Système de pseudo-îlots humains pour l’évaluation synchrone de la dynamique des biocapteurs fluorescents et des profils de sécrétion hormonale

Résumé

Ce protocole décrit une méthode d’acquisition synchrone et de co-enregistrement d’événements de signalisation intracellulaire et de sécrétion d’insuline et de glucagon par des pseudo-îlots humains primaires en utilisant l’administration adénovirale d’un biocapteur d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc), d’un détecteur de différence d’AMPc in situ (cADDis) et d’un système de micropérifusion.

Résumé

Les îlots pancréatiques de Langerhans, qui sont de petites collections 3D de cellules endocriniennes et de soutien spécialisées disséminées dans tout le pancréas, jouent un rôle central dans le contrôle de l’homéostasie du glucose par la sécrétion d’insuline par les cellules bêta, ce qui abaisse la glycémie, et de glucagon par les cellules alpha, qui augmente la glycémie. Les voies de signalisation intracellulaires, y compris celles médiées par l’AMPc, sont essentielles à la sécrétion régulée d’hormones alpha et bêta des cellules. La structure 3D des îlots pancréatiques, bien qu’essentielle à la coordination de la fonction des îlots pancréatiques, présente des défis expérimentaux pour les études mécanistiques des voies de signalisation intracellulaires dans les cellules primaires des îlots pancréatiques humains. Pour surmonter ces défis et ces limitations, ce protocole décrit une plate-forme intégrée d’imagerie et de microfluidique de cellules vivantes utilisant des pseudo-îlots humains primaires générés à partir de donneurs non diabétiques qui ressemblent à des îlots natifs dans leur morphologie, leur composition et leur fonction. La taille de ces pseudo-îlots est contrôlée par le processus de dispersion et de réagrégation des cellules primaires des îlots pancréatiques humains. À l’état dispersé, l’expression des gènes des cellules des îlots pancréatiques peut être manipulée ; par exemple, des biocapteurs tels que le biocapteur d’AMPc génétiquement codé, cADDis, peuvent être introduits. Une fois formés, les pseudo-îlots exprimant un biocapteur génétiquement codé, en combinaison avec la microscopie confocale et une plateforme de micropérifusion, permettent l’évaluation synchrone de la dynamique des biocapteurs fluorescents et des profils de sécrétion des hormones alpha et bêta des cellules alpha et bêta afin de mieux comprendre les processus et la fonction cellulaires.

Introduction

Les îlots de Langerhans sont des mini-organes disséminés dans tout le pancréas dont la fonction est cruciale pour le maintien de l’homéostasie du glucose. L’insuline est sécrétée par les cellules bêta à la suite du métabolisme du glucose, d’une augmentation du rapport ATP/ADP, de la fermeture des canaux potassiques sensibles à l’ATP, d’une dépolarisation de la membrane plasmique et de l’afflux de calcium extracellulaire¹. La sécrétion de glucagon par les cellules alpha est moins comprise, mais il a été postulé que les voies intracellulaires et paracrines contribuent à l’exocytose des granules de glucagon ^2,3,4....

Protocole

Les îlots humains (N = 4 préparations) ont été obtenus grâce à des partenariats avec le Programme de distribution intégrée des îlots pancréatiques, le Programme d’analyse du pancréas humain, Prodo Laboratories, Inc. et Imagine Pharma. Le comité d’examen institutionnel de l’Université Vanderbilt ne considère pas les spécimens pancréatiques humains anonymisés comme des recherches sur des sujets humains. Ce travail ne serait pas possible sans les donneurs d’organes, leurs familles et les organismes d’approvisionnement en organes. Voir le tableau 1 pour obtenir des renseignements démographiques sur les donateurs. Les îlots humains provenant de donneurs de....

Discussion

L’intégration d’un système de micropérifusion, de pseudo-îlots exprimant des biocapteurs et d’une microscopie confocale à balayage laser permet l’évaluation synchrone des événements de signalisation intracellulaire et des profils dynamiques de sécrétion hormonale. Le système de micropérifusion dynamique peut fournir une série de stimuli bien définis aux pseudo-îlots et permet la collecte de l’effluent, dans laquelle les concentrations d’insuline et de glucagon peuvent être mesurées par ELISA .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad-CMV-cADDis	Welgen	Not applicable
0.01” FEP tubing	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubes	Any	Any
10 μm PTFE filter	Cole-Parmer	SK-21940-41	Change every 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070	Enriched-CMRL Media Component
190 proof Ethanol	Decon labs	2816	Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement	Gibco	35050061	Enriched-CMRL Media Component
Ascorbate	Sigma	A5960	DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7888	DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA 96-well Microplates	Perkin Elmer	6055330
cellSens analysis software	Olympus	v3.1	Software used for data analysis
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Enriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528	Glucose Buffer Component
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamber	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	12306C	Enriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Glucagon Kit HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Any	Any	Acid Ethanol Component
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium Supplement	Cell Dynamics	M1019	iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulin ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)	Sigma	I5879	Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscope	Olympus	FV3000
L-Glutamine	Sigma	G8540	DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)	University of Miami	FP-3W
Microchip holder	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector	Biorad	7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tips	Any	Any
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump	Instech	P720
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	Wash Islets
Sarstedt dishes	Sarstedt	depends on dish diameter
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6014	DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)	Millipore	SCGP00525	Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component