Système de pseudo-îlots humains pour l’évaluation synchrone de la dynamique des biocapteurs fluorescents et des profils de sécrétion hormonale

Résumé

Ce protocole décrit une méthode d’acquisition synchrone et de co-enregistrement d’événements de signalisation intracellulaire et de sécrétion d’insuline et de glucagon par des pseudo-îlots humains primaires en utilisant l’administration adénovirale d’un biocapteur d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc), d’un détecteur de différence d’AMPc in situ (cADDis) et d’un système de micropérifusion.

Résumé

Les îlots pancréatiques de Langerhans, qui sont de petites collections 3D de cellules endocriniennes et de soutien spécialisées disséminées dans tout le pancréas, jouent un rôle central dans le contrôle de l’homéostasie du glucose par la sécrétion d’insuline par les cellules bêta, ce qui abaisse la glycémie, et de glucagon par les cellules alpha, qui augmente la glycémie. Les voies de signalisation intracellulaires, y compris celles médiées par l’AMPc, sont essentielles à la sécrétion régulée d’hormones alpha et bêta des cellules. La structure 3D des îlots pancréatiques, bien qu’essentielle à la coordination de la fonction des îlots pancréatiques, présente des défis expérimentaux pour les études mécanistiques des voies de signalisation intracellulaires dans les cellules primaires des îlots pancréatiques humains. Pour surmonter ces défis et ces limitations, ce protocole décrit une plate-forme intégrée d’imagerie et de microfluidique de cellules vivantes utilisant des pseudo-îlots humains primaires générés à partir de donneurs non diabétiques qui ressemblent à des îlots natifs dans leur morphologie, leur composition et leur fonction. La taille de ces pseudo-îlots est contrôlée par le processus de dispersion et de réagrégation des cellules primaires des îlots pancréatiques humains. À l’état dispersé, l’expression des gènes des cellules des îlots pancréatiques peut être manipulée ; par exemple, des biocapteurs tels que le biocapteur d’AMPc génétiquement codé, cADDis, peuvent être introduits. Une fois formés, les pseudo-îlots exprimant un biocapteur génétiquement codé, en combinaison avec la microscopie confocale et une plateforme de micropérifusion, permettent l’évaluation synchrone de la dynamique des biocapteurs fluorescents et des profils de sécrétion des hormones alpha et bêta des cellules alpha et bêta afin de mieux comprendre les processus et la fonction cellulaires.

Introduction

Les îlots de Langerhans sont des mini-organes disséminés dans tout le pancréas dont la fonction est cruciale pour le maintien de l’homéostasie du glucose. L’insuline est sécrétée par les cellules bêta à la suite du métabolisme du glucose, d’une augmentation du rapport ATP/ADP, de la fermeture des canaux potassiques sensibles à l’ATP, d’une dépolarisation de la membrane plasmique et de l’afflux de calcium extracellulaire¹. La sécrétion de glucagon par les cellules alpha est moins comprise, mais il a été postulé que les voies intracellulaires et paracrines contribuent à l’exocytose des granules de glucagon ^2,3,4. Le diabète de type 1 et le diabète de type 2 sont associés à un dysfonctionnement des cellules des îlots pancréatiques ^5,6,7. Par conséquent, l’élucidation des voies de signalisation intracellulaires médiant la sécrétion d’hormones des îlots pancréatiques est essentielle pour comprendre les mécanismes physiologiques et pathologiques des îlots pancréatiques.

L’architecture sphérique des îlots présente certains obstacles à l’expérimentation. Ces défis comprennent la variation de la taille des îlots et la nature 3D des îlots, ce qui réduit la transduction virale dans le noyau des îlots ^8,9. Pour surmonter ces défis, un système de pseudo-îlots a été développé, dans lequel les îlots humains primaires sont dispersés en cellules uniques, transduits adénovialement avec des constructions codant pour des cibles d’intérêt, et réagrégés pour former des structures ressemblant à des îlots de taille contrôlée appelées pseudo-îlots⁷. Comparés aux îlots natifs du même donneur qui ont été cultivés en parallèle, ces pseudo-îlots sont similaires en termes de morphologie, de composition des cellules endocrines et de sécrétion d’hormones⁷. Cette méthode permet l’expression de constructions dans tout le pseudo-îlot, ce qui signifie qu’elle surmonte un obstacle antérieur à la manipulation génétique uniforme des îlots humains primaires ^7,8,9.

Dans ce protocole, le système de pseudo-îlots pancréatiques est intégré à un dispositif microfluidique pour exprimer des biocapteurs dans les cellules primaires des îlots pancréatiques humains et obtenir une résolution temporelle de la sécrétion d’hormone pseudo-îlots au cours de la périfusion dynamique^10,11,12. Les pseudo-îlots sont placés dans une micropuce et exposés à un flux constant de différents sécrétagogues via une pompe péristaltique¹². La micropuce a un fond en verre transparent et est montée sur un microscope confocal pour enregistrer la dynamique de signalisation intracellulaire via les changements d’intensité de fluorescence du biocapteur. L’imagerie par biocapteur est synchronisée avec le prélèvement d’effluents de micropérifusion pour l’analyse ultérieure de la sécrétion d’insuline et de glucagon⁷. Par rapport à la macropérifusion, cette approche de micropérifusion permet d’utiliser moins de pseudo-îlots en raison du volume plus petit du dispositif microfluidique par rapport à la chambre de macropérifusion⁷.

Pour exploiter l’utilité de ce système, le biocapteur cyclique de détection de différence d’adénosine monophosphate (AMPc) in situ (cADDis) a été exprimé dans des pseudo-îlots humains afin d’évaluer la dynamique de l’AMPc et la sécrétion d’hormones. Le biocapteur cADDis est composé d’une protéine fluorescente verte permutée circulairement (cpGFP) positionnée dans la région charnière d’une protéine d’échange activée par l’AMPc 2 (EPAC2), reliant ses régions régulatrices et catalytiques. La liaison de l’AMPc à la région régulatrice de l’EPAC2 provoque un changement conformationnel dans la région de la charnière qui augmente la fluorescence du cpGFP¹³. Les messagers intracellulaires tels que l’AMPc provoquent la sécrétion d’insuline et de glucagon après l’activation en amont des récepteurs couplés aux protéines G¹⁴. L’imagerie de cellules vivantes couplée à la micropérifusion permet de relier la dynamique de l’AMPc intracellulaire à la sécrétion d’hormones des îlots pancréatiques. Plus précisément, dans ce protocole, des pseudo-îlots exprimant cADDis sont générés pour surveiller les réponses de l’AMPc dans les cellules alpha et bêta à divers stimuli : faible taux de glucose (2 mM de glucose ; G 2), hyperglycémie et isobutylméthylxanthine (IBMX ; 20 mM de glucose + 100 μM IBMX ; G 20 + IBMX) et un faible taux de glucose et d’épinéphrine (Epi ; 2 mM de glucose + 1 μM Epi ; G 2 + Epi). Ce flux de travail de traitement permet d’évaluer la dynamique de l’AMPc intracellulaire directement via 1) l’inhibition de la phosphodiestérase médiée par IBMX, qui améliore les niveaux d’AMPc intracellulaire en empêchant sa dégradation, et 2) l’épinéphrine, un stimulateur connu de l’AMPc dépendant de la sécrétion de glucagon des cellules alpha médié par l’activation du récepteur β-adrénergique. Les étapes de mise en place de l’appareil de micropérifusion pour les expériences d’imagerie de cellules vivantes, le chargement des pseudo-îlots dans la micropuce, l’imagerie synchrone des cellules vivantes et la micropérifusion, ainsi que l’analyse des traces de biocapteurs et de la sécrétion hormonale par des dosages hormonaux sur microplaque sont détaillées ci-dessous.

Protocole

Les îlots humains (N = 4 préparations) ont été obtenus grâce à des partenariats avec le Programme de distribution intégrée des îlots pancréatiques, le Programme d’analyse du pancréas humain, Prodo Laboratories, Inc. et Imagine Pharma. Le comité d’examen institutionnel de l’Université Vanderbilt ne considère pas les spécimens pancréatiques humains anonymisés comme des recherches sur des sujets humains. Ce travail ne serait pas possible sans les donneurs d’organes, leurs familles et les organismes d’approvisionnement en organes. Voir le tableau 1 pour obtenir des renseignements démographiques sur les donateurs. Les îlots humains provenant de donneurs de pancréas non diabétiques ont été isolés avec moins de 15 h d’ischémie froide.

1. Formation de pseudo-îlots (détaillée dans Walker et al.⁷)

1. Prélever et prélever à la main des îlots humains primaires à l’aide d’une pipette P200 et d’un microscope de paillasse, en veillant à ne pas contaminer la pointe de la pipette sur des surfaces situées à l’extérieur du milieu de culture des îlots pancréatiques (10 % de FBS, 100 μg/mL de streptomycine, 100 U/mL de pénicilline, 2 mM de L-glutamine dans CMRL 1066).
2. Transférez les îlots primaires dans un tube de 15 ml et effectuez toutes les étapes de formation des pseudo-îlots sous une hotte de culture tissulaire pour éviter la contamination. Dissocier lentement les îlots primaires pendant 7 min à température ambiante à l’aide d’une pipette P1000 dans 0,025% de trypsine. La solution deviendra opaque au fur et à mesure que les îlots commenceront à se désagréger.
   1. Pour ces études, 200 à 300 îlots primaires choisis à la main avec des diamètres d’environ 200 μm dispersés dans 500 μL de trypsine à 0,025 % donnent une à deux plaques de pseudo-îlots à 96 puits ; Le nombre exact peut varier en fonction de la taille moyenne et de la viabilité des îlots. Pour > 500 îlots primaires, augmenter le volume de trypsine à 0,025 % utilisé dans un rapport de 1 :1 (p. ex., 600 μL de trypsine à 0,025 % pour 600 îlots cueillis à la main).
3. Éteignez la dispersion en ajoutant un volume de Vanderbilt Pseudoislet Media (VPM) équivalent au volume de trypsine utilisé. Ensuite, laver deux fois avec 1 mL de VPM. Pour les lavages, centrifuger les cellules dispersées à 485 x g pendant 2-3 min à 4 °C dans une centrifugeuse de paillasse. Suspendez à nouveau les cellules dans un volume défini de VPM (généralement 1 mL) pour le comptage.
   NOTE : La génération de pseudo-îlots et la composition du VPM sont détaillées dans une publication antérieure⁷. En bref, VPM contient des volumes égaux de milieu enrichi en CMRL (20 % de FBS, 100 μg/mL de streptomycine, 100 U/mL de pénicilline, 1 mM de pyruvate de sodium, 2 mM de Glutamax, 2 mM de HEPES dans CMRL 1066) et d’iEC-media (VEGF Medium Complete Kit moins FBS + 1 flacon de Endothelial Cells Medium Supplement). Un schéma sommaire de la génération de pseudo-îlots est inclus dans la figure 1A.
4. Déterminez le nombre de cellules et leur viabilité à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé en combinant 10 μL de bleu de trypan avec 10 μL de suspension cellulaire. Mélangez bien la suspension cellulaire pour assurer un comptage précis des cellules.
5. Calculez le volume de suspension cellulaire, de virus et de VPM requis pour le nombre souhaité de pseudo-îlots. Basez tous les calculs sur le nombre de cellules vivantes obtenu à l’étape 1.4.
   1. Dans le cadre de ces études, transduction de cellules d’îlots pancréatiques humains dispersées à un moment d’inertie de 500 (N = 1) ou de 1 000 (N = 2) avec Ad-CMV-cADDis dans un volume total de 500 μL. Une plaque de pseudo-îlots transduits (2 000 cellules/pseudo-îlots) donne trois répétitions techniques par donneur (32 pseudo-îlots/expérience). L’adénovirus a été obtenu commercialement dans le cadre de ce travail.
6. Combinez les quantités calculées de suspension cellulaire, de virus et de VPM dans un tube de 1,5 ml. Mélangez délicatement le contenu en pipetant de haut en bas.
7. Pendant la transduction, incuber les tubes avec des bouchons ouverts, et les recouvrir d’une boîte de Pétri stérile pendant 2 h dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C et 5 % de CO₂/95 % d’air.
8. Ajouter 500 μL de VPM dans chaque tube, et laver les cellules en les centrifugeant à 500 x g pendant 3 min à 4 °C. Effectuez deux autres lavages pour un total de trois lavages. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de VPM.
9. Calculer le volume total d’ensemencement des cellules (200 μL/pseudo-îlot). Ajouter le VPM (le volume d’ensemencement calculé de la cellule moins 2 mL) dans un tube conique de taille appropriée. Ajouter la suspension cellulaire transduite de l’étape 1.7 au tube conique. Gardez le tube conique légèrement fermé mais pas hermétiquement fermé pour permettre l’échange d’air pour les cellules.
10. Rincez le tube de 1,5 mL (à partir de l’étape 1.7) avec 1 mL de VPM et transférez le contenu dans le tube conique, auquel cas le tube conique doit contenir le volume total d’ensemencement des cellules.
11. Bien mélanger le contenu du tube conique en pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette sérologique motorisée, puis transférer le contenu dans un réservoir de réactif stérile. Si le réservoir ne contient pas la totalité du volume d’ensemencement de la cellule, effectuez des transferts en série et assurez-vous que la suspension est bien mélangée à chaque étape.
12. À l’aide d’une pipette multicanal P200, pipeter la suspension cellulaire dans le réservoir de réactif de haut en bas 3 à 4 fois pour assurer l’homogénéité, puis pipeter 200 μL de la suspension cellulaire dans chaque puits des plaques de micropuits.
13. Incuber les pseudo-îlots dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C et 5 % de CO₂/95 % d’air pendant 6 jours sans changement de milieu. Au jour 6, les pseudo-îlots devraient être complètement formés et prêts pour les expériences (Figure 1B-D).

2. Préparation à l’imagerie des cellules vivantes et à la micropérifusion (1 jour avant l’expérience)

NOTA : Des renseignements sur la préparation du milieu de micropérifusion sont disponibles dans la ressource protocols.io (https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html).

1. Prélever les pseudo-îlots à l’aide d’une pipette multicanaux en les transférant de la plaque à 96 puits dans une boîte de Pétri stérile. Ensuite, cueillez à la main les pseudo-îlots et transférez-les dans une autre boîte de Pétri stérile contenant du VPM frais. Laisser les pseudo-îlots incuber dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C et à 5 % de CO₂/95 % d’air pendant la nuit.
2. Préparez 1 L de DMEM en ajoutant 1 g de BSA (de qualité radio-immunologique), 0,11 g de pyruvate de sodium, 0,58 g de L-glutamine, 3,2 g de bicarbonate de sodium, 1,11 g de HEPES et 1 bouteille de DMEM à 1 L d’eau ultra-purifiée. Préparer une solution mère de glucose à 1 M dans le DMEM. Conservez les deux solutions à 4 °C pendant la nuit.
3. Vérifier le débit du système de micropérifusion la veille de l’expérience. Connectez tous les tubes à un porte-puce contenant une micropuce vide, comme indiqué à la figure 2A-B. Utiliser de l’eau ultra-purifiée comme effluent pour confirmer un débit de 100 μL/min au collecteur de fractions.

3. Ajout de sécrétagogues au DMEM (jour de l’expérience)

1. Ajouter 0,07 mg/mL d’ascorbate au DMEM et préparer les sécrétagogues dans un tampon DMEM + ascorbate à l’aide d’un stock de glucose de 1 M pour les tampons contenant du glucose.
   REMARQUE : L’ascorbate est utilisé pour stabiliser l’épinéphrine en empêchant son oxydation. Si l’épinéphrine n’est pas utilisée, l’ascorbate peut être omis du DMEM.
2. Filtrez les sécrétagogues deux fois à travers un filtre à pores de 0,22 μm, en utilisant un filtre neuf à chaque fois. Réchauffez les solutions à 37 °C et mesurez le glucose à l’aide d’un glucomètre pour confirmer la concentration souhaitée.

4. Configuration de l’appareil de micropérifusion

1. Réchauffez la chambre environnementale d’un microscope confocal à balayage laser à 37 °C, en veillant à ce que toutes les portes soient fermées et que la chambre maintienne une température stable. Placez le porte-puce contenant la micropuce dans la chambre pour le réchauffer. Vérifiez la température des copeaux à l’aide d’un pistolet infrarouge.
   REMARQUE : Dans ce cas, la chambre climatique est réglée sur 38,5 °C, ce qui permet à la puce d’atteindre 37 °C.
2. Connectez tous les tubes au porte-copeaux (comme indiqué à la Figure 2A-B). Rimpez avec le sécrétagogue de base pendant 5 min. Dans cette étude, la ligne a été rincée avec 2 mM de glucose (G 2). Changez la membrane du piège à bulles du débarboteur toutes les 8 à 10 expériences.

5. Chargement des pseudo-îlots dans la micropuce

1. Avant de charger la micropuce, prenez une image en fond clair et en fond noir (grossissement 10x) des pseudo-îlots qui seront utilisés dans l’expérience pour la quantification ultérieure des équivalents d’îlots (QEI).
   REMARQUE : Le QEI est utilisé pour normaliser la sécrétion hormonale aux variations du nombre d’îlots pancréatiques au cours des expériences. Cette étape peut également être effectuée la veille de l’expérience.
2. Aspirez tout liquide supplémentaire des moitiés inférieure et supérieure de la micropuce. La moitié supérieure de la micropuce contient des joints d’étanchéité qui assurent une étanchéité adéquate de chaque puits, tandis que la moitié inférieure de la micropuce contient les puits avec une lamelle de verre attachée. Pré-mouiller un puits dans la micropuce avec 5 μL de DMEM. Assurez-vous de pipeter autour des bords extérieurs du puits pour mouiller les crevasses.
3. À l’aide d’une pipette pré-humidifiée, prélever 30 à 32 pseudo-îlots dans un volume de 23 μL et distribuer lentement les pseudo-îlots au centre du puits, dans la partie inférieure de la micropuce. Vérifiez que l’extrémité de la pipette n’est pas constituée de pseudo-îlots qui auraient pu être fixés.
4. Utilisez un embout de chargement de gel pour manœuvrer doucement les pseudo-îlots au centre du puits. Cela garantit que le nombre maximal de pseudo-îlots sera capturé dans un champ de vision.
5. Prenez une image des pseudo-îlots dans la micropuce sur le stéréoscope. Ce nombre sera utilisé pour ajuster la QEI calculée pour toute perte de pseudo-îlots au cours de ce processus.
   1. Si tous les pseudo-îlots de l’étape 5.3 ne sont pas chargés dans la micropuce, ajustez l’IEQ en conséquence. Par exemple, si 30 pseudo-îlots sont visualisés maintenant, mais que 32 ont été visualisés à l’étape 5.1, calculez la QEI sur les images de l’étape 5.1, puis multipliez par 30/32.
6. Placez le bas de la micropuce dans le porte-micropuce. Placez délicatement le haut de la micropuce avec le joint vert vers le bas.
7. Tout en maintenant la micropuce en place, fermez doucement le porte-micropuce pour serrer la micropuce ensemble. Essayez de ne pas appliquer de pression excessive sur la micropuce pendant ce processus, car cela déplacerait le fluide contenu dans le puits et pourrait entraîner une perte de pseudo-îlots. Évitez d’introduire des bulles d’air dans le puits.

6. Imagerie synchrone de cellules vivantes et micropérifusion

1. Transférez les sécrétagogues, la pompe et la micropuce dans le support dans la chambre environnementale installée sur le microscope confocal. Dirigez la tubulure d’efflux hors de la chambre vers le collecteur de fractions.
   1. Placez les tampons dans des tubes coniques de 15 ml avec des ouvertures percées dans leurs bouchons. Ces trous empêchent le tube de collecte de dériver hors du tube.
   2. Lorsque vous vissez le tube dans le débarboteur, séparez l’écrou et la virole, puis vissez le débarboteur. Cela permet d’éviter la torsion de la ligne.
2. Réglez le collecteur de fractions pour qu’il tourne toutes les 2 minutes. Charger le nombre approprié de tubes dans le collecteur de fractions, en tenant compte des lavages et des fractions expérimentales. Pour ces expériences, 15 tubes de lavage (30 min de lavage total) et 28 tubes pour la collecte des fractions ont été utilisés.
3. Démarrer la pompe pour délivrer le milieu de référence (contenant la concentration de glucose de base) à 100 μL/min (une collecte de 2 minutes à un débit de 100 μL/min donne 200 μL d’effluent par tube de fraction). Ce débit a été choisi pour limiter la contrainte sur les pseudo-îlots et éviter un mouvement important des pseudo-îlots lors de l’imagerie en direct.
   1. Pendant que le fluide circule dans l’appareil, surveillez les points suivants :
      1. Surveillez les gouttelettes à l’extrémité du bec collecteur de fractions, qui indiquent l’écoulement dans le système.
      2. Surveillez la diminution de l’efflux du système ; s’il y a <200 μL dans les tubes de collecte, cela indique qu’il pourrait y avoir un blocage ou une fuite dans le système. Voir le tableau 2 pour une liste des causes potentielles de la diminution du volume d’effluent, des solutions et des conseils de prévention.
4. Une fois qu’il y a un débit de fluide constant à partir du tube d’efflux, tournez la tête du collecteur de fractions pour distribuer dans les tubes et démarrez le collecteur de fractions. Prélever les 15 premières fractions (30 min) au lavage pour permettre aux pseudo-îlots de s’équilibrer. Utilisez ces 15 premières fractions pour assurer un débit continu et précis du fluide dans le système. Jetez ces fractions par la suite.
5. Pendant le lavage de 30 minutes, réglez le microscope pour l’imagerie des cellules vivantes en fonction des paramètres suivants : objectif : U Plan Fluorite 20x avec zoom 1x ; canaux de fluorescence : EGFP (émission = 510 nm, longueur d’onde laser = 488, longueur d’onde de détection = 500-600 nm) ; série temporelle : image acquise toutes les 2 s pendant toute la durée de l’expérience (c’est-à-dire 56 min) ; Vitesse d’échantillonnage : 2 μs/pixel.
   1. Identifiez le bas des pseudo-îlots dans le champ de vision et ajustez le plan focal à 15 μm au-dessus de cette position. C’est le cadre qui sera utilisé tout au long de l’expérience d’imagerie.
6. Une fois le lavage de 30 minutes terminé, commencez la collecte des fractions et l’acquisition d’images.
   REMARQUE : Tous les efforts doivent être faits pour identifier et corriger tout problème avant cette étape. Une fois la collecte de données commencée, toute pause dans l’expérience ou toute exposition excessive aux sécrétagogues peut avoir un effet négatif sur les résultats.
7. Continuer à parcourir les pseudo-îlots avec un milieu de base pendant toute la durée de la première collecte de base, en recueillant l’effluent dans des tubes de 1,5 ml. Passez manuellement de la tubulure du tampon de base au nouveau tube tampon de stimulus lorsque le moment est approprié pour l’expérience.
   1. Une séquence standard de micropérifusion est présentée dans le tableau 3.
   2. Après avoir collecté ~10 fractions, placez toutes les fractions dans un réfrigérateur à 4 °C jusqu’à la fin de l’expérience pour éviter la dégradation des hormones, en particulier du glucagon.
   3. Continuez à surveiller le débit du système tout au long de l’expérience en vérifiant le volume d’effluent dans chaque tube.
8. Lorsque l’expérience est terminée, revenez au milieu de référence et laissez la pompe continuer à fonctionner pendant 5 minutes pour éliminer le stimulus avec le milieu de base (dans ce cas, 2 mM de glucose).
9. Arrêtez la pompe et débranchez le tube du porte-micropuce au niveau du débarboteur et du collecteur de fractions pour retirer le porte-micropuce de la chambre environnementale. Fermez toutes les portes après avoir retiré la micropuce pour maintenir la température.
10. Conservez les périfusats à −80 °C pour une analyse hormonale ultérieure.

7. Extraction à l’éthanol acide des pseudo-îlots

1. Ouvrez délicatement le porte-micropuce et soulevez-le du haut de la micropuce. À l’aide d’une pipette et d’un microscope de paillasse, prélever des pseudo-îlots du puits et les transférer dans un tube de 1,5 ml. Assurer le prélèvement de tous les pseudo-îlots à l’aide d’un microscope de paillasse si nécessaire.
   1. Prenez une image finale des pseudo-îlots dans la micropuce avant de les retirer du puits pour ajuster la QEI d’extraction des îlots, comme à l’étape 5.5.
2. Laver deux fois avec 500 μL de PBS. Essorer les pseudo-îlots pendant 1 min à 94 x g entre chaque lavage et aspirer le surnageant.
3. Après avoir retiré le dernier lavage, ajouter 200 μL d’éthanol acide (5,5 mL d’éthanol à 95 % + 50 μL de HCl 12 N). Conserver à 4 °C toute la nuit.
4. Le lendemain, essorez les extraits pendant 10 min à 15 989 x g et à 4 °C. Aliquote 45 μL dans trois nouveaux tubes. Conserver à −80 °C pour l’analyse de la teneur en hormones. Au lieu de normaliser la sécrétion hormonale à la QEI, la sécrétion hormonale peut également être normalisée à la teneur en hormone des pseudo-îlots de Langerhans mesurée à partir des extraits.

8. Expériences supplémentaires et nettoyage

1. Répétez les étapes 5 à 7 avec les groupes suivants de pseudo-îlots pour obtenir des répliques techniques supplémentaires.
2. Après avoir terminé toutes les expériences de micropérifusion, faites couler de l’eau de Javel à 10 % dans la micropuce et le tube pendant 5 minutes, puis de l’eau ultra-purifiée pendant 30 minutes pour désinfecter le tube.

9. Analyse des données

REMARQUE : L’imagerie des cellules vivantes a été réalisée à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Les images ont été analysées à l’aide du logiciel d’imagerie associé au microscope. Les lignes directrices suivantes sont générales, mais peuvent différer selon le fabricant du microscope et le logiciel d’acquisition d’images.

1. Détermination du nombre total d’équivalents d’îlots (QEI) pour la normalisation des données
   1. Ouvrez le logiciel et cliquez sur l’onglet Acquisition en haut à droite de la fenêtre. Gravure par lots dans toutes les images à fond noir en sélectionnant la fonction Gravure par lots dans le Gestionnaire de macros (Fenêtres de l’outil Affichage > > Gestionnaire de macros).
      1. Pour graver plusieurs images à la fois, cliquez sur le bouton Basculer le mode batch avant de cliquer sur le bouton Exécuter dans le gestionnaire de macros. Suivez les instructions à l’écran pour sélectionner l’emplacement de l’image source et l’emplacement de destination des images gravées. Pour le type de fichier image, choisissez Tagged Imagine File Format (*.tif)).
   2. Pour la mesure de la QIE, ouvrez la version gravée de l’image en fond noir 10x prise à l’étape 5.1. Cliquez sur l’onglet Comptage et mesure en haut de l’écran, puis cliquez sur le bouton Seuil HSV manuel à gauche.
      1. Utilisez la fonction compte-gouttes pour ajouter/supprimer la zone positive (en rouge) jusqu’à ce que chaque pseudo-îlot soit surligné en rouge, sans dépasser la bordure du pseudo-îlot. Cliquez sur Compter et mesurer.
   3. Utilisez les fonctions de fractionnement automatique ou de fractionnement manuel pour fractionner les pseudo-îlots qui ont été joints.
      1. Pour fractionner manuellement les pseudo-îlots, choisissez la fonction de fractionnement manuel, cliquez avec le bouton gauche de la souris pour tracer une ligne séparant les pseudo-îlots, puis cliquez avec le bouton droit de la souris pour terminer la ligne. Pour fractionner automatiquement, choisissez la fonction de fractionnement automatique et cliquez sur les pseudo-îlots groupés qui vous intéressent. Confirmez ensuite le fractionnement automatique correct.
   4. Dans les images gravées par lots, la barre d’échelle et le texte d’agrandissement peuvent être marqués comme positifs. Supprimez ces objets pour un comptage précis en mettant en surbrillance le texte et la barre d’échelle à l’aide de la souris et en appuyant sur la touche Suppr du clavier.
   5. Activez et désactivez le filtre pour confirmer que tous les pseudo-îlots sont comptés. Le fichier peut également être ouvert en dehors du programme pour des références croisées. Lorsque vous avez terminé, cliquez sur Exporter vers Excel.
   6. Ouvrez la feuille de calcul et modifiez-la comme suit.
      1. Supprimez les informations de dénombrement, de moyenne et de tri en bas. Triez les objets en fonction de leur diamètre moyen. Insérez une colonne après le diamètre moyen et nommez la colonne « Nombre de pseudo-îlots ».
      2. Le nombre d’îlots est déterminé par le nombre de pseudo-îlots dont le diamètre moyen se situe dans chaque indice inférieur. Multipliez le nombre de pseudo-îlots par indice par le facteur de conversion de QEI respectif et additionnez ces valeurs pour déterminer la QEI totale. Effectuez les calculs de QEI sur les images acquises avant chaque expérience. Utilisez les indices et les facteurs de conversion IEQ suivants :
         1 à 49 μm : × 0,167
         50 à 100 μm : × 0,667
         101 à 150 μm : × 1,685
         151-200 μm : × 3.500
         201 à 300 μm : × 6,315
         301 à 350 μm : × 10,352
      3. Pour obtenir un exemple de feuille de calcul permettant de déterminer le nombre de QEI, voir Fichier supplémentaire 1.
2. Quantification de l’imagerie de cellules vivantes dans un logiciel
   1. Ouvrez le fichier souhaité (.oir) dans cellSens.
   2. Désignez les régions d’intérêt (ROI) comme suit.
      1. Utilisez les outils de dessin pour désigner les ROI (c’est-à-dire chaque pseudo-îlot). Si vous utilisez l’option de dessin à main levée, cliquez avec le bouton droit de la souris pour fermer la forme.
      2. Mettez en surbrillance tous les ROI à l’aide de la flèche et faites-la glisser pour englober tous les ROI de l’image. Une fois tous les ROI mis en surbrillance, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Convertir en retour sur investissement dynamique au fil du temps
      3. Lisez le fichier XYT pour confirmer que les ROI sont exacts au fil du temps. Si le retour sur investissement n’est pas précis à une période donnée, corrigez sa taille/son emplacement à cette période. Le logiciel ajustera progressivement la taille/l’emplacement du retour sur investissement au fil du temps pour correspondre à ces changements. Répétez ces étapes jusqu’à ce que le retour sur investissement soit précis tout au long de l’expérience d’imagerie.
   3. Effectuez des mesures d’intensité sur chaque retour sur investissement comme suit.
      1. Dans la barre d’outils, cliquez sur Mesurer le profil d’intensité. Mettez en évidence les retours sur investissement à analyser ; utilisez Maj + clic pour sélectionner plusieurs ROI.
         REMARQUE : Bien que plusieurs fichiers puissent être ouverts à la fois dans le logiciel, n’analysez les ROI qu’à partir d’un seul fichier à la fois.
      2. Pour tenir compte du bruit de fond, sélectionnez une valeur constante à soustraire de chaque valeur d’intensité ou désignez un retour sur investissement comme bruit de fond. Cliquez sur Exécuter.
      3. Dans la barre d’outils Profil d’intensité , cliquez sur Exporter vers Excel pour exporter les données.
      4. Normaliser tous les points de données à la moyenne des intensités mesurées de 7 à 8 min (c’est-à-dire la dernière minute de la première périfusion moyenne de base). Ces valeurs normalisées à chaque point temporel sont définies comme l’intensité relative de cADDis. Pour obtenir un exemple de feuille de calcul d’analyse et de normalisation des données d’imagerie, voir Fichier supplémentaire 2.
3. Mesurez la sécrétion hormonale dans chaque fraction et extrait d’îlots. Dans ces expériences, les concentrations d’insuline et de glucagon ont été mesurées par ELISA. Normaliser la sécrétion hormonale dans chaque fraction au volume des pseudo-îlots pancréatiques à l’aide des mesures de QEI déterminées à l’étape 9.1 ou par la teneur en hormone extraite.

Résultats

Des pseudo-îlots humains exprimant des biocapteurs ont été créés par l’administration adénovirale de constructions codant pour le biocapteur d’AMPc, cADDis (Figure 1A). La figure 1B montre la réagrégation des cellules d’îlots humains transduites au fil du temps, avec des pseudo-îlots complètement formés observés après 6 jours de culture. Les cellules ont commencé à montrer une fluorescence visible de cADDis dans les 48 heures, et i...

Discussion

L’intégration d’un système de micropérifusion, de pseudo-îlots exprimant des biocapteurs et d’une microscopie confocale à balayage laser permet l’évaluation synchrone des événements de signalisation intracellulaire et des profils dynamiques de sécrétion hormonale. Le système de micropérifusion dynamique peut fournir une série de stimuli bien définis aux pseudo-îlots et permet la collecte de l’effluent, dans laquelle les concentrations d’insuline et de glucagon peuvent être mesurées par ELISA ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad-CMV-cADDis	Welgen	Not applicable
0.01” FEP tubing	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubes	Any	Any
10 μm PTFE filter	Cole-Parmer	SK-21940-41	Change every 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070	Enriched-CMRL Media Component
190 proof Ethanol	Decon labs	2816	Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement	Gibco	35050061	Enriched-CMRL Media Component
Ascorbate	Sigma	A5960	DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7888	DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA 96-well Microplates	Perkin Elmer	6055330
cellSens analysis software	Olympus	v3.1	Software used for data analysis
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Enriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528	Glucose Buffer Component
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamber	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	12306C	Enriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Glucagon Kit HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Any	Any	Acid Ethanol Component
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium Supplement	Cell Dynamics	M1019	iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulin ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)	Sigma	I5879	Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscope	Olympus	FV3000
L-Glutamine	Sigma	G8540	DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)	University of Miami	FP-3W
Microchip holder	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector	Biorad	7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tips	Any	Any
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump	Instech	P720
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	Wash Islets
Sarstedt dishes	Sarstedt	depends on dish diameter
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6014	DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)	Millipore	SCGP00525	Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component