Sistema de pseudoislotes humanos para la evaluación sincrónica de la dinámica de biosensores fluorescentes y perfiles de secreción de hormonas

Resumen

Este protocolo describe un método para la adquisición sincrónica y el co-registro de eventos de señalización intracelular y la secreción de insulina y glucagón por pseudoislotes humanos primarios utilizando la administración adenoviral de un biosensor de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), un detector de diferencia de cAMP in situ (cADDis) y un sistema de microperifusión.

Resumen

Los islotes pancreáticos de Langerhans, que son pequeñas colecciones 3D de células endocrinas y de soporte especializadas intercaladas por todo el páncreas, tienen un papel central en el control de la homeostasis de la glucosa a través de la secreción de insulina por parte de las células beta, que reduce la glucosa en sangre, y glucagón por parte de las células alfa, que eleva la glucosa en sangre. Las vías de señalización intracelular, incluidas las mediadas por AMPc, son clave para la secreción regulada de hormonas alfa y beta de las células. La estructura 3D de los islotes, si bien es esencial para la función coordinada de los islotes, presenta desafíos experimentales para los estudios mecanicistas de las vías de señalización intracelular en las células primarias de los islotes humanos. Para superar estos desafíos y limitaciones, este protocolo describe una plataforma integrada de imágenes de células vivas y microfluídica que utiliza pseudoislotes humanos primarios generados a partir de donantes sin diabetes que se asemejan a los islotes nativos en su morfología, composición y función. Estos pseudoislotes están controlados por tamaño a través del proceso de dispersión y reagregación de las células primarias de los islotes humanos. En el estado disperso, la expresión génica de las células de los islotes se puede manipular; por ejemplo, se pueden introducir biosensores como el biosensor de AMPc codificado genéticamente, cADDis. Una vez formados, los pseudoislotes que expresan un biosensor codificado genéticamente, en combinación con la microscopía confocal y una plataforma de microperifusión, permiten la evaluación sincrónica de la dinámica de los biosensores fluorescentes y los perfiles de secreción de hormonas de las células alfa y beta para proporcionar más información sobre los procesos y la función celular.

Introducción

Los islotes de Langerhans son mini órganos repartidos por todo el páncreas cuya función es crucial para el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa. La insulina es secretada por las células beta tras el metabolismo de la glucosa, el aumento de la relación ATP/ADP, el cierre de los canales de potasio sensibles al ATP, la despolarización de la membrana plasmática y la entrada de calcio extracelular^. La secreción de glucagón de las células alfa es menos conocida, pero se ha postulado que las vías intracelulares y paracrinas contribuyen a la exocitosis de los gránulos de glucagón ^2,3,4....

Protocolo

Los islotes humanos (preparaciones N = 4) se obtuvieron a través de asociaciones con el Programa Integrado de Distribución de Islotes, el Programa de Análisis de Páncreas Humano, Prodo Laboratories, Inc. e Imagine Pharma. La Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Vanderbilt no considera especímenes pancreáticos humanos no identificados como investigación con sujetos humanos. Este trabajo no sería posible sin los donantes de órganos, sus familias y las organizaciones de procuración de órganos. Consulte la Tabla 1 para obtener información demográfica de los donantes. Se aislaron islotes humanos de donantes de páncreas sin diabetes con meno....

Discusión

La integración de un sistema de microperifusión, pseudoislotes que expresan biosensores y microscopía confocal de barrido láser permite la evaluación sincrónica de los eventos de señalización intracelular y los perfiles dinámicos de secreción de hormonas. El sistema dinámico de microperifusión puede entregar una serie de estímulos bien definidos a los pseudoislotes y permite la recolección del efluente, en el que las concentraciones de insulina y glucagón pueden medirse mediante ELISA disponible comercialm.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad-CMV-cADDis	Welgen	Not applicable
0.01” FEP tubing	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubes	Any	Any
10 μm PTFE filter	Cole-Parmer	SK-21940-41	Change every 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070	Enriched-CMRL Media Component
190 proof Ethanol	Decon labs	2816	Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement	Gibco	35050061	Enriched-CMRL Media Component
Ascorbate	Sigma	A5960	DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7888	DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA 96-well Microplates	Perkin Elmer	6055330
cellSens analysis software	Olympus	v3.1	Software used for data analysis
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Enriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528	Glucose Buffer Component
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamber	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	12306C	Enriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Glucagon Kit HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Any	Any	Acid Ethanol Component
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium Supplement	Cell Dynamics	M1019	iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulin ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)	Sigma	I5879	Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscope	Olympus	FV3000
L-Glutamine	Sigma	G8540	DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)	University of Miami	FP-3W
Microchip holder	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector	Biorad	7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tips	Any	Any
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump	Instech	P720
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	Wash Islets
Sarstedt dishes	Sarstedt	depends on dish diameter
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6014	DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)	Millipore	SCGP00525	Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component