Sistema de pseudoislotes humanos para la evaluación sincrónica de la dinámica de biosensores fluorescentes y perfiles de secreción de hormonas

Resumen

Este protocolo describe un método para la adquisición sincrónica y el co-registro de eventos de señalización intracelular y la secreción de insulina y glucagón por pseudoislotes humanos primarios utilizando la administración adenoviral de un biosensor de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), un detector de diferencia de cAMP in situ (cADDis) y un sistema de microperifusión.

Resumen

Los islotes pancreáticos de Langerhans, que son pequeñas colecciones 3D de células endocrinas y de soporte especializadas intercaladas por todo el páncreas, tienen un papel central en el control de la homeostasis de la glucosa a través de la secreción de insulina por parte de las células beta, que reduce la glucosa en sangre, y glucagón por parte de las células alfa, que eleva la glucosa en sangre. Las vías de señalización intracelular, incluidas las mediadas por AMPc, son clave para la secreción regulada de hormonas alfa y beta de las células. La estructura 3D de los islotes, si bien es esencial para la función coordinada de los islotes, presenta desafíos experimentales para los estudios mecanicistas de las vías de señalización intracelular en las células primarias de los islotes humanos. Para superar estos desafíos y limitaciones, este protocolo describe una plataforma integrada de imágenes de células vivas y microfluídica que utiliza pseudoislotes humanos primarios generados a partir de donantes sin diabetes que se asemejan a los islotes nativos en su morfología, composición y función. Estos pseudoislotes están controlados por tamaño a través del proceso de dispersión y reagregación de las células primarias de los islotes humanos. En el estado disperso, la expresión génica de las células de los islotes se puede manipular; por ejemplo, se pueden introducir biosensores como el biosensor de AMPc codificado genéticamente, cADDis. Una vez formados, los pseudoislotes que expresan un biosensor codificado genéticamente, en combinación con la microscopía confocal y una plataforma de microperifusión, permiten la evaluación sincrónica de la dinámica de los biosensores fluorescentes y los perfiles de secreción de hormonas de las células alfa y beta para proporcionar más información sobre los procesos y la función celular.

Introducción

Los islotes de Langerhans son mini órganos repartidos por todo el páncreas cuya función es crucial para el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa. La insulina es secretada por las células beta tras el metabolismo de la glucosa, el aumento de la relación ATP/ADP, el cierre de los canales de potasio sensibles al ATP, la despolarización de la membrana plasmática y la entrada de calcio extracelular^. La secreción de glucagón de las células alfa es menos conocida, pero se ha postulado que las vías intracelulares y paracrinas contribuyen a la exocitosis de los gránulos de glucagón ^2,3,4. Tanto la diabetes tipo 1 como la diabetes tipo 2 se asocian con disfunción de las células de los islotes ^5,6,7. Por lo tanto, dilucidar las vías de señalización intracelular que median la secreción de hormonas de los islotes es esencial para comprender los mecanismos fisiológicos y patológicos en los islotes pancreáticos.

La arquitectura esférica de los islotes presenta ciertos obstáculos para la experimentación. Estos desafíos incluyen la variación del tamaño de los islotes y la naturaleza 3D de los islotes, lo que reduce la transducción viral dentro del núcleo del islote ^8,9. Para superar estos desafíos, se desarrolló un sistema de pseudoislotes, en el que los islotes humanos primarios se dispersan en células individuales, se transducen adenoviralmente con construcciones que codifican objetivos de interés y se vuelven a agregar para formar estructuras similares a islotes de tamaño controlado denominadas pseudoislotes⁷. En comparación con los islotes nativos del mismo donante que se han cultivado en paralelo, estos pseudoislotes son similares en morfología, composición de células endocrinas y secreción de hormonas⁷. Este método permite la expresión de constructos a lo largo del pseudoislote, lo que significa que supera una barrera previa para la manipulación genética uniforme de los islotes humanos primarios ^7,8,9.

En este protocolo, el sistema de pseudoislotes se integra con un dispositivo microfluídico para expresar biosensores en células primarias de islotes humanos y obtener resolución temporal de la secreción de hormonas de pseudoislotes durante la perifusión dinámica^10,11,12. Los pseudoislotes se colocan en un microchip y se exponen a un flujo constante de diferentes secretagogos a través de una bomba peristáltica¹². El microchip tiene un fondo de vidrio transparente y está montado en un microscopio confocal para registrar la dinámica de señalización intracelular a través de cambios en la intensidad de fluorescencia del biosensor. Las imágenes de los biosensores se sincronizan con la recogida del efluente de microperifusión para el posterior análisis de la secreción de insulina y glucagón⁷. En comparación con la macroperifusión, este enfoque de microperifusión permite utilizar menos pseudoislotes debido al menor volumen del dispositivo microfluídico en comparación con la cámara de macroperifusión⁷.

Para aprovechar la utilidad de este sistema, se expresó el biosensor detector de diferencias in situ de monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) (cADDis) en pseudoislotes humanos para evaluar la dinámica del AMPc y la secreción de hormonas. El biosensor cADDis está compuesto por una proteína verde fluorescente permutada circularmente (cpGFP) posicionada en la región bisagra de una proteína de intercambio activada por cAMP 2 (EPAC2), conectando sus regiones reguladoras y catalíticas. La unión del AMPc a la región reguladora de EPAC2 provoca un cambio conformacional en la región de bisagra que aumenta la fluorescencia del cpGFP¹³. Los mensajeros intracelulares, como el AMPc, provocan la secreción de insulina y glucagón después de la activación ascendente de los receptores acoplados a proteínas G¹⁴. Las imágenes de células vivas junto con la microperifusión ayudan a conectar la dinámica intracelular del AMPc con la secreción de hormonas de los islotes. En concreto, en este protocolo se generan pseudoislotes que expresan cADDis para monitorizar las respuestas de AMPc en células alfa y beta a diversos estímulos: glucosa baja (2 mM de glucosa; G 2), glucosa alta más isobutilmetilxantina (IBMX; 20 mM de glucosa + 100 μM de IBMX; G 20 + IBMX) y glucosa baja más epinefrina (Epi; 2 mM de glucosa + 1 μM Epi; G 2 + Epi). Este flujo de trabajo de tratamiento permite la evaluación de la dinámica del AMPc intracelular directamente a través de 1) la inhibición de la fosfodiesterasa mediada por IBMX, que mejora los niveles intracelulares de AMPc al prevenir su degradación, y 2) la epinefrina, un conocido estimulador dependiente del AMPc de la secreción de glucagón de las células alfa mediada por la activación del receptor β-adrenérgico. A continuación se detallan los pasos para configurar el aparato de microperifusión para experimentos de imágenes de células vivas, la carga de los pseudoislotes en el microchip, la obtención de imágenes sincrónicas de células vivas y la microperifusión, y el análisis de las trazas de biosensores y la secreción de hormonas mediante ensayos hormonales basados en microplacas.

Protocolo

Los islotes humanos (preparaciones N = 4) se obtuvieron a través de asociaciones con el Programa Integrado de Distribución de Islotes, el Programa de Análisis de Páncreas Humano, Prodo Laboratories, Inc. e Imagine Pharma. La Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Vanderbilt no considera especímenes pancreáticos humanos no identificados como investigación con sujetos humanos. Este trabajo no sería posible sin los donantes de órganos, sus familias y las organizaciones de procuración de órganos. Consulte la Tabla 1 para obtener información demográfica de los donantes. Se aislaron islotes humanos de donantes de páncreas sin diabetes con menos de 15 h de tiempo de isquemia fría.

1. Formación de pseudoislotes (detallada en Walker et al.⁷)

1. Obtener y seleccionar a mano los islotes humanos primarios utilizando una pipeta P200 y un microscopio de sobremesa, prestando especial atención a no contaminar la punta de la pipeta en ninguna superficie fuera del medio de cultivo de los islotes (10% de FBS, 100 μg/ml de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina, 2 mM de L-glutamina en CMRL 1066).
2. Transfiera los islotes primarios a un tubo de 15 ml y realice todos los siguientes pasos de formación de pseudoislotes bajo una campana de cultivo de tejidos para evitar la contaminación. Disociar lentamente los islotes primarios durante 7 min a temperatura ambiente con una pipeta P1000 en tripsina al 0,025%. La solución se volverá opaca a medida que los islotes comiencen a romperse.
   1. Para estos estudios, 200-300 islotes primarios seleccionados a mano con diámetros de aproximadamente 200 μm dispersos en 500 μL de tripsina al 0,025% producen una o dos placas de pseudoislotes de 96 pocillos; El número exacto puede variar según el tamaño promedio de los islotes y la viabilidad. Para >500 islotes primarios, amplíe el volumen de tripsina al 0,025 % utilizado en una proporción de 1:1 (p. ej., 600 μl de tripsina al 0,025 % para 600 islotes seleccionados a mano).
3. Apague la dispersión agregando un volumen de medios de pseudoislotes de Vanderbilt (VPM) equivalente al volumen de tripsina utilizado. A continuación, lavar dos veces con 1 ml de VPM. Para los lavados, centrifugar las células dispersas a 485 x g durante 2-3 min a 4 °C en una centrífuga de sobremesa. Vuelva a suspender las células en un volumen definido de VPM (normalmente 1 ml) para el recuento.
   NOTA: La generación de pseudoislotes y la composición de VPM se detallan en una publicación anterior⁷. En resumen, VPM contiene volúmenes iguales de medios CMRL enriquecidos (20% de FBS, 100 μg/ml de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina, 1 mM de piruvato de sodio, 2 mM de Glutamax, 2 mM de HEPES en CMRL 1066) y medios iEC (VEGF Medium Complete Kit menos FBS + 1 botella de Endotelial Cells Medium Supplement). En la Figura 1A se incluye un esquema resumido de la generación de pseudoislotes.
4. Determine el recuento de células y la viabilidad utilizando un contador celular automatizado combinando 10 μL de azul de tripano con 10 μL de la suspensión celular. Mezcle bien la suspensión celular para garantizar un recuento celular preciso.
5. Calcule el volumen de suspensión celular, virus y VPM necesarios para el número deseado de pseudoislotes. Basar todos los cálculos en el recuento de células vivas obtenido en el paso 1.4.
   1. Para estos estudios, transducir células de islotes humanos dispersos a MOI 500 (N = 1) o 1.000 (N = 2) con Ad-CMV-cADDis en un volumen total de 500 μL. Una placa de pseudoislotes transducidos (2.000 células/pseudoislote) produce tres réplicas técnicas por donante (32 pseudoislotes/experimento). El adenovirus se obtuvo comercialmente en este trabajo.
6. Combine las cantidades calculadas de suspensión celular, virus y VPM en un tubo de 1,5 ml. Mezcle suavemente el contenido pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
7. Durante la transducción, incubar los tubos con los tapones abiertos y cubrirlos con una placa de Petri estéril durante 2 h en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C y 5% de CO₂/95% de aire.
8. Añadir 500 μL de VPM a cada tubo y lavar las células centrifugando a 500 x g durante 3 min a 4 °C. Completa dos lavados más para un total de tres lavados. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 ml de VPM.
9. Calcular el volumen total de siembra celular (200 μL/pseudoislote). Agregue el VPM (el volumen de siembra celular calculado menos 2 mL) a un tubo cónico de tamaño adecuado. Agregue la suspensión celular transducida del paso 1.7 al tubo cónico. Mantenga el tubo cónico ligeramente cerrado pero no herméticamente cerrado para permitir el intercambio de aire para las células.
10. Enjuague el tubo de 1,5 ml (del paso 1.7) con 1 ml de VPM y transfiera el contenido al tubo cónico, momento en el que el tubo cónico debe contener el volumen total de siembra celular.
11. Mezcle bien el contenido del tubo cónico pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica motorizada y, a continuación, transfiera el contenido a un depósito de reactivo estéril. Si el depósito no contiene todo el volumen de siembra de la célula, realice transferencias en serie y asegúrese de que la suspensión esté bien mezclada en cada paso.
12. Con una pipeta P200 multicanal, pipetear la suspensión celular en el depósito de reactivo hacia arriba y hacia abajo 3-4 veces para garantizar la homogeneidad y, a continuación, pipetear 200 μL de la suspensión celular en cada pocillo de las placas de micropocillos.
13. Incubar los pseudoislotes en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C y 5% CO₂/95% aire durante 6 días sin cambios de medio. Para el día 6, los pseudoislotes deberían estar completamente formados y listos para los experimentos (Figura 1B-D).

2. Preparación para la obtención de imágenes de células vivas y microperifusión (1 día antes del experimento)

NOTA: La información sobre la preparación del medio de microperifusión está disponible a través del recurso protocols.io (https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html).

1. Coseche los pseudoislotes con una pipeta multicanal transfiriéndolos de la placa de 96 pocillos a una placa de Petri estéril. Luego, recoja a mano los pseudoislotes y transfiéralos a otra placa de Petri estéril que contenga VPM fresco. Dejar incubar los pseudoislotes en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C y 5% de CO₂/95% de aire durante la noche.
2. Prepare 1 L de DMEM añadiendo 1 g de BSA (grado de radioinmunoensayo), 0,11 g de piruvato de sodio, 0,58 g de L-glutamina, 3,2 g de bicarbonato de sodio, 1,11 g de HEPES y 1 botella de DMEM a 1 L de agua ultrapurificada. Prepare una solución madre de glucosa 1 M en DMEM. Mantenga ambas soluciones a 4 °C durante la noche.
3. Comprobar el flujo del sistema de microperifusión el día anterior al experimento. Conecte todos los tubos a un soporte de chip que contenga un microchip vacío, como se describe en la Figura 2A-B. Utilice agua ultrapurificada como efluente para confirmar un caudal de 100 μL/min en el colector de fracciones.

3. Adición de secretagogos al DMEM (día del experimento)

1. Añadir 0,07 mg/ml de ascorbato al DMEM, y preparar los secretagogos en DMEM + tampón ascorbato utilizando un stock de glucosa 1 M para los tampones que contienen glucosa.
   NOTA: El ascorbato se utiliza para estabilizar la epinefrina evitando su oxidación. Si no se usa epinefrina, el ascorbato se puede omitir del DMEM.
2. Filtre los secretagogos dos veces a través de un filtro de poros de 0,22 μm, utilizando un filtro nuevo cada vez. Calentar las soluciones a 37 °C y medir la glucosa a través de un glucómetro para confirmar la concentración deseada.

4. Configuración del aparato de microperifusión

1. Caliente la cámara ambiental de un microscopio de barrido láser confocal a 37 °C, asegurándose de que todas las puertas estén cerradas y de que la cámara mantenga una temperatura estable. Coloque el soporte de virutas que contiene el microchip en la cámara para calentarlo. Verifique la temperatura del chip con una pistola de infrarrojos.
   NOTA: En este caso, la cámara ambiental se ajusta a 38,5 °C, lo que permite que el chip alcance los 37 °C.
2. Conecte todos los tubos al soporte de la viruta (como se describe en la Figura 2A-B). Enrasar con el secretagogo de línea de base durante 5 min. En este estudio, la línea se lavó con 2 mM de glucosa (G2). Cambie la membrana de la trampa de burbujas del desburbujeador cada 8-10 experimentos.

5. Carga de los pseudoislotes en el microchip

1. Antes de cargar el microchip, tome una imagen de campo claro y campo oscuro (aumento de 10x) de los pseudoislotes que se utilizarán en el experimento para la posterior cuantificación de equivalentes de islotes (IEQ).
   NOTA: El IEQ se utiliza para normalizar la secreción de hormonas a variaciones en el número de islotes a lo largo de los experimentos. Este paso también se puede realizar el día anterior al experimento.
2. Aspire cualquier exceso de líquido de las mitades inferior y superior del microchip. La mitad superior del microchip contiene juntas que aseguran un sellado adecuado de cada pocillo, mientras que la mitad inferior del microchip contiene los pocillos con un cubreobjetos de vidrio adjunto. Humedezca previamente un pocillo en el microchip con 5 μL de DMEM. Asegúrate de pipetear alrededor de los bordes exteriores del pozo para humedecer las grietas.
3. Utilice una pipeta prehumedecida para recoger 30-32 pseudoislotes en un volumen de 23 μL y dispense lentamente los pseudoislotes en el centro del pocillo en la pieza inferior del microchip. Compruebe si hay pseudoislotes en la punta de la pipeta que puedan haberse adherido.
4. Use una punta de carga de gel para maniobrar suavemente los pseudoislotes en el centro del pozo. Esto garantiza que se capture el máximo número de pseudoislotes en un campo de visión.
5. Tome una imagen de los pseudoislotes en el microchip del estereoscopio. Este recuento se utilizará para ajustar el IEQ calculado para cualquier pérdida de pseudoislotes durante este proceso.
   1. Si todos los pseudoislotes del paso 5.3 no están cargados en el microchip, ajuste el IEQ en consecuencia. Por ejemplo, si ahora se visualizan 30 pseudoislotes, pero 32 se visualizaron en el paso 5.1, calcule el IEQ en las imágenes del paso 5.1 y, a continuación, multiplíquelo por 30/32.
6. Coloque la parte inferior del microchip en el soporte del microchip. Coloque con cuidado la parte superior del microchip con la junta verde hacia abajo.
7. Mientras sostiene el microchip en su lugar, cierre suavemente el soporte del microchip para sujetar el microchip. Trate de no aplicar una presión excesiva sobre el microchip durante este proceso, ya que hacerlo desplazará el líquido contenido en el pocillo y puede provocar la pérdida de pseudoislotes. Evite introducir burbujas de aire en el pozo.

6. Obtención de imágenes sincrónicas de células vivas y microperifusión

1. Transfiera los secretagogos, la bomba y el microchip en el soporte a la cámara ambiental instalada en el microscopio confocal. Dirija el tubo de eflujo fuera de la cámara hacia el colector de fracciones.
   1. Coloque los tampones en tubos cónicos de 15 ml con aberturas perforadas en sus tapas. Estos orificios evitan que el tubo de recolección se salga del tubo.
   2. Al atornillar el tubo en el desburbujeador, separe la tuerca y la férula y, a continuación, atorníllelo en el desburbujeador. Esto evita la torsión de la línea.
2. Configure el colector de fracciones para que gire cada 2 minutos. Cargue el número adecuado de tubos en el colector de fracciones, teniendo en cuenta los lavados y las fracciones experimentales. Para estos experimentos, se utilizaron 15 tubos de lavado (30 min de lavado total) y 28 tubos para la recolección de fracciones.
3. Ponga en marcha la bomba para suministrar el medio de referencia (que contiene la concentración de glucosa de referencia) a 100 μL/min (una recogida de 2 minutos a un caudal de 100 μL/min da como resultado 200 μL de efluente por cada tubo de fracción). Este caudal se eligió para limitar la tensión en los pseudoislotes y evitar un movimiento significativo de los pseudoislotes durante la obtención de imágenes en vivo.
   1. Mientras el líquido corre a través del aparato, esté atento a lo siguiente:
      1. Esté atento a las gotas en el extremo de la boca del colector de fracciones, que indican el flujo a través del sistema.
      2. Esté atento a las disminuciones en el flujo del sistema; si hay <200 μL en los tubos de recolección, esto indica que podría haber una obstrucción o fuga en el sistema. Consulte la Tabla 2 para obtener una lista de las posibles causas de la disminución del volumen de efluentes, soluciones y consejos de prevención.
4. Una vez que haya un flujo de medio constante desde el tubo de eflujo, gire el cabezal del colector de fracciones para dispensar en los tubos y encienda el colector de fracciones. Recoja las primeras 15 fracciones (30 min) como lavado para permitir que los pseudoislotes se equilibren. Utilice estas primeras 15 fracciones para garantizar un flujo continuo y preciso del medio a través del sistema. Desecha estas fracciones después.
5. Durante el lavado de 30 minutos, configure el microscopio para obtener imágenes de células vivas de acuerdo con estos parámetros: lente del objetivo: U Plan Fluorite 20x con zoom de 1x; canales de fluorescencia: EGFP (emisión = 510 nm, longitud de onda del láser = 488, longitud de onda de detección = 500-600 nm); series temporales: imagen adquirida cada 2 s durante la totalidad del experimento (es decir, 56 min); Velocidad de muestreo: 2 μs/píxel.
   1. Identifique la parte inferior de los pseudoislotes en el campo de visión y ajuste el plano focal a 15 μm por encima de esta posición. Este es el marco que se utilizará a lo largo del experimento de imágenes.
6. Una vez que se complete el lavado de 30 minutos, comience la recolección de fracciones y la adquisición de imágenes.
   NOTA: Se debe hacer todo lo posible para identificar y corregir cualquier problema antes de este paso. Una vez que comienza la recolección de datos, cualquier pausa en el experimento o exposición excesiva a secretagogos puede afectar negativamente los resultados.
7. Continúe perifundiendo los pseudoislotes con medio de referencia durante la primera recolección de referencia, recolectando el efluente en tubos de 1,5 mL. Cambie el tubo del tampón de referencia con la mano al nuevo tubo tampón de estímulo cuando sea el momento apropiado para el experimento.
   1. En la Tabla 3 se muestra una secuencia estándar de microperifusión.
   2. Después de recolectar ~ 10 fracciones, coloque todas las fracciones en un refrigerador a 4 ° C hasta el final del experimento para evitar la degradación de las hormonas, especialmente el glucagón.
   3. Continúe monitoreando el flujo del sistema durante todo el experimento verificando el volumen de efluente en cada tubo.
8. Una vez finalizado el experimento, vuelva al medio de referencia y deje que la bomba continúe funcionando durante 5 minutos para eliminar el estímulo con el medio de referencia (en este caso, 2 mM de glucosa).
9. Detenga la bomba y desconecte el tubo del soporte del microchip en el desburbujeador y el colector de fracciones para retirar el soporte del microchip de la cámara ambiental. Cierre todas las puertas después de quitar el microchip para mantener la temperatura.
10. Almacenar los perifusatos a -80 °C para su posterior análisis hormonal.

7. Extracción de etanol ácido pseudoislote

1. Abra con cuidado el soporte del microchip y levante la parte superior del microchip. Utilice una pipeta y un microscopio de sobremesa para extraer los pseudoislotes del pocillo y transferirlos a un tubo de 1,5 ml. Asegurar la recolección de todos los pseudoislotes utilizando un microscopio de sobremesa si es necesario.
   1. Tome una imagen final de los pseudoislotes en el microchip antes de retirarlos del pocillo para ajustar el IEQ del extracto de islotes, similar al paso 5.5.
2. Lavar dos veces con 500 μL de PBS. Centrifugar los pseudoislotes durante 1 minuto a 94 x g entre cada lavado y aspirar el sobrenadante.
3. Después de retirar el último lavado, añadir 200 μL de etanol ácido (5,5 mL de etanol al 95% + 50 μL de HCl 12 N). Conservar a 4 °C durante la noche.
4. Al día siguiente, centrifugar los extractos durante 10 minutos a 15.989 x g y 4 °C. Alícuota 45 μL en tres tubos nuevos. Almacenar a -80 °C para el análisis del contenido hormonal. Como alternativa a la normalización de la secreción hormonal al IEQ, la secreción hormonal también puede normalizarse al contenido de hormonas de los pseudoislotes medido a partir de los extractos.

8. Experimentos adicionales y limpieza

1. Repita los pasos 5 a 7 con grupos posteriores de pseudoislotes para obtener réplicas técnicas adicionales.
2. Después de terminar todos los experimentos de microperifusión, pase lejía al 10% a través del microchip y el tubo durante 5 minutos y luego agua ultrapurificada durante 30 minutos para desinfectar el tubo.

9. Análisis de datos

NOTA: Las imágenes de células vivas se realizaron con un microscopio confocal de barrido láser. Las imágenes se analizaron utilizando el paquete de software de imágenes asociado al microscopio. Las siguientes son pautas generales, pero pueden diferir según el fabricante del microscopio y el software de adquisición de imágenes.

1. Determinación de los equivalentes totales de islotes (IEQ) para la normalización de datos
   1. Abra el programa de software y haga clic en la pestaña Adquisición en la parte superior derecha de la ventana. Graba por lotes en todas las imágenes de campo oscuro seleccionando la función Grabar por lotes en el Administrador de macros (Ver > Herramientas Ventanas > Administrador de macros).
      1. Para grabar varias imágenes a la vez, haga clic en el botón Alternar modo por lotes antes de hacer clic en el botón Ejecutar dentro del Administrador de macros. Siga las instrucciones que aparecen en pantalla para seleccionar la ubicación de la imagen de origen y la ubicación de destino de las imágenes grabadas. Para el tipo de archivo de imagen, elija Formato de archivo Tagged Imagine (*.tif).
   2. Para la medición del IEQ, abra la versión quemada de la imagen de campo oscuro de 10x tomada en el paso 5.1. Haga clic en la pestaña Recuento y medición en la parte superior y elija el botón Umbral manual de HSV a la izquierda.
      1. Utilice la función de cuentagotas para añadir/eliminar el área positiva (en rojo) hasta que cada pseudoislote se resalte en rojo, sin extenderse más allá del borde del pseudoislote. Haga clic en Contar y medir.
   3. Utilice las funciones de división automática o división manual para dividir los pseudoislotes que se unieron.
      1. Para dividir manualmente los pseudoislotes, elija la función de división manual, haga clic con el botón izquierdo para dibujar una línea que separe los pseudoislotes y, a continuación, haga clic con el botón derecho para completar la línea. Para dividir automáticamente, elija la función de división automática y haga clic en los pseudoislotes agrupados de interés. Confirme la división automática correcta después.
   4. En las imágenes grabadas por lotes, la barra de escala y el texto de ampliación pueden marcarse como positivos. Elimine estos objetos para obtener un recuento preciso resaltando el texto y la barra de escala con el ratón y pulsando la tecla Suprimir del teclado.
   5. Activa y desactiva el filtro para confirmar que se están contando todos los pseudoislotes. El archivo también se puede abrir fuera del programa para hacer referencias cruzadas. Cuando termines, haz clic en Exportar a Excel.
   6. Abra la hoja de cálculo y modifíquela de la siguiente manera.
      1. Elimine la información de recuento, valor medio y ordenación en la parte inferior. Ordene los objetos en función de su diámetro medio. Inserte una columna después del diámetro medio y asigne a la columna el nombre "Recuento de pseudoislotes".
      2. El recuento de islotes está determinado por el número de pseudoislotes con diámetros medios que se encuentran dentro de cada índice a continuación. Multiplique el número de pseudoislotes por índice por el factor de conversión IEQ respectivo y sume estos valores para determinar el IEQ total. Realice los cálculos de IEQ en las imágenes adquiridas antes de cada experimento. Utilice los siguientes índices y factores de conversión IEQ:
         1-49 μm: × 0,167
         50-100 μm: × 0,667
         101-150 μm: × 1,685
         151-200 μm: × 3.500
         201-300 μm: × 6.315
         301-350 μm: × 10.352
      3. Para ver un ejemplo de hoja de cálculo para determinar los recuentos de IEQ, consulte Archivo complementario 1.
2. Cuantificación de imágenes de células vivas en software
   1. Abra el archivo deseado (.oir) en cellSens.
   2. Designe las regiones de interés (ROI) de la siguiente manera.
      1. Utilice las herramientas de dibujo para designar los ROI (es decir, cada pseudoislote). Si utiliza la opción de dibujo a mano alzada, haga clic con el botón derecho para cerrar la forma.
      2. Resalte todos los ROI usando la flecha de la mano y arrastrándola para abarcar todos los ROI en la imagen. Con todos los ROI resaltados, haga clic con el botón derecho y seleccione Convertir en ROI dinámico a lo largo del tiempo
      3. Reproduzca el archivo XYT para confirmar que los ROI son precisos a lo largo del tiempo. Si el ROI no es preciso en un período específico, corrija su tamaño/ubicación en ese período. El software ajustará gradualmente el tamaño/ubicación del ROI a lo largo del tiempo para que coincida con estos cambios. Repita estos pasos hasta que el ROI sea preciso durante todo el experimento de imágenes.
   3. Realice mediciones de intensidad en cada ROI de la siguiente manera.
      1. En la barra de herramientas, haga clic en Medir perfil de intensidad. Resalta los ROI a analizar; use shift + clic para seleccionar varios ROI.
         NOTA: Si bien es posible que haya varios archivos abiertos a la vez en el software, solo analice el ROI de un archivo a la vez.
      2. Para tener en cuenta el ruido de fondo, seleccione un valor constante para restar de cada valor de intensidad o designe un ROI como fondo. Haga clic en Ejecutar.
      3. Dentro de la barra de herramientas Perfil de intensidad , haga clic en Exportar a Excel para exportar los datos.
      4. Normalice todos los puntos de datos al promedio de las intensidades medidas a partir de 7-8 min (es decir, el último min de la primera perifusión del medio de referencia). Estos valores normalizados en cada punto de tiempo se definen como la intensidad relativa de cADDis. Para ver un ejemplo de hoja de cálculo de análisis y normalización de datos de imágenes, consulte Archivo complementario 2.
3. Mida la secreción de hormonas en cada fracción y extracto de islotes. En estos experimentos, las concentraciones de insulina y glucagón se midieron mediante ELISA. Normalizar la secreción de hormonas en cada fracción al volumen de los pseudoislotes utilizando las mediciones de IEQ determinadas en el paso 9.1 o por el contenido de hormonas del extracto.

Resultados

Los pseudoislotes humanos que expresan biosensores se crearon a través de la administración adenoviral de construcciones que codifican el biosensor cAMP cADDis (Figura 1A). La Figura 1B muestra la reagregación de las células de los islotes humanos transducidos a lo largo del tiempo, con pseudoislotes completamente formados observados después de 6 días de cultivo. Las células comenzaron a mostrar fluorescencia visible de cADDis dentro de las 48 h,...

Discusión

La integración de un sistema de microperifusión, pseudoislotes que expresan biosensores y microscopía confocal de barrido láser permite la evaluación sincrónica de los eventos de señalización intracelular y los perfiles dinámicos de secreción de hormonas. El sistema dinámico de microperifusión puede entregar una serie de estímulos bien definidos a los pseudoislotes y permite la recolección del efluente, en el que las concentraciones de insulina y glucagón pueden medirse mediante ELISA disponible comercialm...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad-CMV-cADDis	Welgen	Not applicable
0.01” FEP tubing	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubes	Any	Any
10 μm PTFE filter	Cole-Parmer	SK-21940-41	Change every 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070	Enriched-CMRL Media Component
190 proof Ethanol	Decon labs	2816	Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement	Gibco	35050061	Enriched-CMRL Media Component
Ascorbate	Sigma	A5960	DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7888	DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA 96-well Microplates	Perkin Elmer	6055330
cellSens analysis software	Olympus	v3.1	Software used for data analysis
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Enriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528	Glucose Buffer Component
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamber	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	12306C	Enriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Glucagon Kit HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Any	Any	Acid Ethanol Component
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium Supplement	Cell Dynamics	M1019	iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulin ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)	Sigma	I5879	Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscope	Olympus	FV3000
L-Glutamine	Sigma	G8540	DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)	University of Miami	FP-3W
Microchip holder	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector	Biorad	7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tips	Any	Any
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump	Instech	P720
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	Wash Islets
Sarstedt dishes	Sarstedt	depends on dish diameter
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6014	DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)	Millipore	SCGP00525	Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component