מערכת פסאודואיסלט אנושית להערכה סינכרונית של דינמיקה ביו-חיישנית פלואורסצנטית ופרופילי הפרשת הורמונים

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לרכישה סינכרונית ורישום משותף של אירועי איתות תוך תאיים והפרשת אינסולין וגלוקגון על ידי פסאודואיסטים אנושיים ראשוניים באמצעות העברה אדנו-ויראלית של ביו-סנסור מחזורי אדנוזין מונופוספט (cAMP), גלאי הפרשי cAMP באתרו (cADDis) ומערכת מיקרופריפיוזיה.

Abstract

איי הלבלב של לנגרהנס, שהם אוספים תלת-ממדיים קטנים של תאים אנדוקריניים ותומכים מיוחדים הפזורים ברחבי הלבלב, הם בעלי תפקיד מרכזי בשליטה על הומאוסטזיס גלוקוז באמצעות הפרשת אינסולין על ידי תאי בטא, אשר מוריד את רמת הגלוקוז בדם, וגלוקגון על ידי תאי אלפא, אשר מעלה את רמת הגלוקוז בדם. מסלולי איתות תוך-תאיים, כולל אלה המתווכים על-ידי cAMP, חיוניים להפרשת הורמוני אלפא ובטא מוסדרים. מבנה האיון התלת-ממדי, אף שהוא חיוני לתפקוד מתואם של האיונים, מציב אתגרים ניסיוניים למחקרים מכניסטיים של מסלולי האיתות התוך-תאיים בתאי איון אנושיים ראשוניים. כדי להתגבר על אתגרים ומגבלות אלה, פרוטוקול זה מתאר דימות משולב של תאים חיים ופלטפורמה מיקרופלואידית באמצעות פסאודואיסטים אנושיים ראשוניים שנוצרו מתורמים ללא סוכרת הדומים לאיונים מקומיים במורפולוגיה, בהרכב ובתפקוד שלהם. פסאודואיסטים אלה נשלטים בגודל באמצעות תהליך הפיזור והצבירה מחדש של תאי איון אנושיים ראשוניים. במצב המפוזר, ביטוי גנים של תאי איון יכול להיות מניפולציה; לדוגמה, ניתן להציג ביו-חיישנים כגון cAMP biosensor המקודד גנטית, cADDis. לאחר היווצרותם, פסאודואיסטים המבטאים ביו-סנסור מקודד גנטית, בשילוב עם מיקרוסקופ קונפוקלי ופלטפורמת מיקרופריפוזיה, מאפשרים הערכה סינכרונית של דינמיקה של ביו-חיישנים פלואורסצנטיים ופרופילי הפרשת הורמוני אלפא ובטא כדי לספק תובנה רבה יותר לגבי תהליכים ותפקוד תאיים.

Introduction

האיים של לנגרהנס הם מיני איברים המפוזרים ברחבי הלבלב שתפקידם חיוני לשמירה על הומאוסטזיס גלוקוז. אינסולין מופרש מתאי בטא בעקבות חילוף חומרים של גלוקוז, עלייה ביחס ATP/ADP, סגירת תעלות אשלגן רגישות ל-ATP, דפולריזציה של קרום הפלזמה וזרימה של סידן¹ חוץ-תאי. הפרשת גלוקגון מתאי אלפא מובנת פחות, אך הועלתה השערה כי מסלולים תוך-תאיים ופרקריניים תורמים לאקסוציטוזה של גרגרי גלוקגון ^2,3,4. הן סוכרת מסוג 1 והן סוכרת מסוג 2 קשורות לתפקוד לקוי של תאי איון ^5,6,7. לכן, הבהרת מסלולי האיתות התוך-תאיים המתווכים את הפרשת הורמון האיון חיונית להבנת מנגנונים פיזיולוגיים ופתולוגיים באיי הלבלב.

הארכיטקטורה הכדורית של איים מציגה מכשולים מסוימים לניסויים. אתגרים אלה כוללים את השונות בגודל האיון ואת הטבע התלת-ממדי של האיונים, אשר מפחית את התמרה נגיפית בתוך ליבת האיון ^8,9. כדי להתגבר על אתגרים אלה, פותחה מערכת פסאודואיסלט, שבה איים אנושיים ראשוניים מפוזרים לתאים בודדים, מומרים אדנו-ויראליות עם מבנים המקודדים מטרות מעניינות, ומצטברים מחדש ליצירת מבנים דמויי איונים מבוקרי גודל המכונים פסאודו-איונים⁷. בהשוואה לאיים מקומיים מאותו תורם שגודלו בתרבית במקביל, פסאודואיסטים אלה דומים במורפולוגיה, בהרכב התאים האנדוקריניים ובהפרשת הורמונים⁷. שיטה זו מאפשרת ביטוי של מבנים ברחבי הפסאודואיון, כלומר היא מתגברת על מחסום קודם למניפולציה גנטית אחידה של איים אנושיים ראשוניים ^7,8,9.

בפרוטוקול זה, מערכת הפסאודואיסלט משולבת עם מכשיר מיקרופלואידי כדי לבטא ביוסנסורים בתאי איון אנושיים ראשוניים ולקבל רזולוציה זמנית של הפרשת הורמון פסאודואיסלט במהלך פריפוזיה דינמית^10,11,12. הפסאודואיסטים מונחים בתוך שבב ונחשפים לזרימה קבועה של סודות שונים באמצעות משאבה פריסטלטית¹². לשבב יש תחתית זכוכית שקופה והוא מורכב על מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להקליט את דינמיקת האיתות התוך תאי באמצעות שינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות של הביו-סנסור. הדמיה Biosensor מסונכרן עם אוסף של שפכי microperifusion לניתוח הבא של אינסולין הפרשת גלוקגון⁷. בהשוואה למקרופריפוזיה, גישת מיקרופריפיוז'ן זו מאפשרת שימוש בפחות פסאודואיסטים בשל הנפח הקטן יותר של המכשיר המיקרופלואידי בהשוואה לתא המקרופריפיוז'ן⁷.

כדי לרתום את התועלת של מערכת זו, הביוסנסור המחזורי אדנוזין מונופוספט (cAMP) מתבטא בפסאודואיסטים אנושיים כדי להעריך דינמיקה של cAMP והפרשת הורמונים. הביוסנסור cADDis מורכב מחלבון פלואורסצנטי ירוק בעל תמורות מעגליות (cpGFP) הממוקם באזור הציר של חלבון חליפין המופעל על ידי cAMP 2 (EPAC2), ומחבר בין אזורי הבקרה והקטליטים שלו. הקישור של cAMP לאזור הרגולציה של EPAC2 מעורר שינוי קונפורמטיבי באזור הציר שמגביר את הפלואורסצנטיות מה-cpGFP¹³. שליחים תוך-תאיים כגון cAMP מעוררים הפרשת אינסולין וגלוקגון לאחר הפעלה במעלה הזרם של קולטנים מצומדים לחלבון G¹⁴. הדמיה של תאים חיים בשילוב עם מיקרופריפוזיה מסייעת לחבר את דינמיקת cAMP תוך תאית עם הפרשת הורמון איון. באופן ספציפי, בפרוטוקול זה, פסאודואיסטים המבטאים cADDis נוצרים כדי לנטר תגובות cAMP בתאי אלפא ובטא לגירויים שונים: גלוקוז נמוך (2 מילימטר גלוקוז; G 2), גלוקוז גבוה בתוספת איזובוטילמתילקסנטין (IBMX; 20 מ"מ גלוקוז + 100 מיקרומטר IBMX; G 20 + IBMX), וגלוקוז נמוך בתוספת אפינפרין (Epi; 2 mM גלוקוז + 1 μM Epi; G 2 + Epi). זרימת עבודה טיפולית זו מאפשרת הערכה של דינמיקת cAMP תוך תאית ישירות באמצעות 1) עיכוב פוספודיאסטראז בתיווך IBMX, אשר משפר את רמות cAMP תוך תאי על ידי מניעת התפרקותו, ו -2) אפינפרין, ממריץ תלוי cAMP ידוע של הפרשת גלוקגון תאי אלפא בתיווך הפעלת קולטן β-אדרנרגי. השלבים להקמת מנגנון המיקרופריפיוז'ן לניסויי הדמיה של תאים חיים, טעינת הפסאודואיסטים לתוך השבב, דימות סינכרוני של תאים חיים ומיקרופריפוזיה, וניתוח עקבות הביו-חיישנים והפרשת הורמונים על ידי בדיקות הורמונים מבוססות מיקרו-צלחות מפורטים להלן.

Protocol

איים אנושיים (N = 4 תכשירים) הושגו באמצעות שותפויות עם תוכנית ההפצה המשולבת של האיים, תוכנית ניתוח הלבלב האנושי, מעבדות פרודו בע"מ ואימג'ין פארמה. ועדת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת ונדרבילט אינה מתייחסת לדגימות לבלב אנושיות לא מזוהות כמחקר בבני אדם. עבודה זו לא הייתה מתאפשרת ללא תורמי איברים, משפחותיהם וארגונים לרכישת איברים. ראו טבלה 1 למידע דמוגרפי על תורמים. איים אנושיים מתורמי לבלב ללא סוכרת בודדו עם פחות מ -15 שעות של זמן איסכמיה קרה.

1. היווצרות Pseudoislet (מפורט ב Walker et al.⁷)

1. השג ובחר ידנית איים אנושיים ראשוניים באמצעות פיפטה P200 ומיקרוסקופ benchtop, תוך שימת לב רבה לא לזהם את קצה פיפטה על משטחים מחוץ למדיום תרבית האיים (10% FBS, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 100 U/mL פניצילין, 2 mM L-גלוטמין ב- CMRL 1066).
2. העבר איים ראשוניים לתוך צינור של 15 מ"ל, ובצע את כל שלבי היווצרות הפסאודואיסלט הבאים תחת מכסה מנוע של תרבית רקמה כדי למנוע זיהום. נתקו באיטיות את האיים הראשיים למשך 7 דקות בטמפרטורת החדר עם פיפטה P1000 ב-0.025% טריפסין. הפתרון יהפוך לאטום כאשר האיים יתחילו להתפרק.
   1. עבור מחקרים אלה, 200-300 איים ראשוניים שנבחרו בקפידה עם קטרים של כ -200 מיקרומטר מפוזרים ב 500 μL של 0.025% טריפסין מניב אחד או שניים לוחות 96 באר של pseudoislets; המספר המדויק עשוי להשתנות בהתאם לגודל האי הממוצע והכדאיות. עבור >500 איים עיקריים, הגדילו את הנפח של 0.025% טריפסין המשמש ביחס של 1:1 (למשל, 600 מיקרוליטר של 0.025% טריפסין עבור 600 איים שנבחרו בקפידה).
3. להרוות את הפיזור על ידי הוספת נפח של Vanderbilt Pseudoislet Media (VPM) שווה ערך לנפח טריפסין בשימוש. לאחר מכן, לשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של VPM. עבור שטיפות, צנטריפוגה את התאים המפוזרים ב 485 x גרם במשך 2-3 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה ספסל. השהה מחדש את התאים בנפח מוגדר של VPM (בדרך כלל 1 מ"ל) לצורך ספירה.
   הערה: דור הפסאודואיסלט והרכב VPM מפורטים בפרסום קודם⁷. בקצרה, VPM מכיל נפחים שווים של מדיה מועשרת CMRL (20% FBS, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 100 U / מ"ל פניצילין, 1 mM נתרן פירובט, 2 mM Glutamax, 2 mM HEPES ב CMRL 1066) ו iEC-media (VEGF Medium Complete Kit פחות FBS + 1 בקבוק של תאים אנדותל תוספת בינונית). סכמת סיכום של יצירת פסאודואיסלט כלולה באיור 1A.
4. קבע את ספירת התאים ואת הכדאיות באמצעות מונה תאים אוטומטי על ידי שילוב של 10 μL של כחול טריפאן עם 10 μL של השעיית התא. ערבבו היטב את מתלה התא כדי להבטיח ספירת תאים מדויקת.
5. חשב את נפח השעיית התא, וירוס ו- VPM הדרושים למספר הרצוי של פסאודו-איים. בסס את כל החישובים על ספירת התאים החיים המתקבלת בשלב 1.4.
   1. עבור מחקרים אלה, התמירו תאי איון אנושיים מפוזרים ב-MOI 500 (N = 1) או 1,000 (N = 2) עם Ad-CMV-cADDis בנפח כולל של 500 μL. צלחת אחת של פסאודואיסלטים מומרים (2,000 תאים/פסאודואיסלט) מניבה שלושה העתקים טכניים לכל תורם (32 פסאודואיסלטים לניסוי). אדנווירוס הושג באופן מסחרי בעבודה זו.
6. שלב את הכמויות המחושבות של תרחיף תאים, וירוסים ו- VPM לצינור של 1.5 מ"ל. מערבבים בעדינות את התוכן על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
7. במהלך ההתמרה יש לדגור על הצינורות בכובעים פתוחים, ולכסות אותם בצלחת פטרי סטרילית למשך שעתיים באינקובטור תרבית רקמות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂/95% אוויר.
8. הוסף 500 μL של VPM לכל צינור, ושטוף את התאים על ידי צנטריפוגה אותם ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C. השלימו שתי שטיפות נוספות ובסך הכל שלוש כביסות. לשאוף supernatant, ולהשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של VPM.
9. חשב את נפח זריעת התאים הכולל (200 μL/pseudoislet). הוסף את ה- VPM (נפח זריעת התאים המחושב פחות 2 מ"ל) לצינור חרוטי בגודל מתאים. הוסף את תרחיף התא המומר משלב 1.7 לצינור החרוט. שמור על הצינור החרוטי סגור מעט אך לא סגור היטב כדי לאפשר חילופי אוויר לתאים.
10. שטוף את הצינור 1.5 מ"ל (משלב 1.7) עם 1 מ"ל של VPM, ולהעביר את התוכן לצינור החרוט, ואז הצינור החרוטי צריך להכיל את נפח הזריעה הכולל של התא.
11. מערבבים היטב את תכולת הצינור החרוטי על ידי פיפטציה למעלה ולמטה עם פיפטה סרולוגית ממונעת, ולאחר מכן מעבירים את התוכן למאגר מגיב סטרילי. אם המאגר אינו מחזיק את כל נפח הזריעה של התא, בצע העברות טוריות וודא כי התרחיף מעורבב היטב בכל שלב.
12. באמצעות פיפטה רב-ערוצית P200, צנרת את תרחיף התא במאגר מגיב למעלה ולמטה 3-4 פעמים כדי להבטיח הומוגניות, ולאחר מכן צינור 200 μL של תרחיף התא לתוך כל באר של לוחות microwell.
13. לדגור על הפסאודואיסטים באינקובטור תרבית רקמה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂/95% אוויר למשך 6 ימים ללא שינויים בינוניים. עד יום 6, הפסאודו-איים צריכים להיווצר באופן מלא ולהיות מוכנים לניסויים (איור 1B-D).

2. הכנה להדמיית תאים חיים ומיקרופריפוזיה (יום לפני הניסוי)

הערה: מידע על הכנת אמצעי microperifusion זמין באמצעות משאב protocols.io (https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html).

1. קוצרים את הפסאודואיסלטים באמצעות פיפטה רב ערוצית על ידי העברתם מצלחת 96 הקידוחים לצלחת פטרי סטרילית. לאחר מכן, בחרו ידנית את הפסאודו-איסלטים, והעבירו אותם לצלחת פטרי סטרילית אחרת המכילה VPM טרי. אפשרו לפסאודואיסטים לדגור באינקובטור תרבית רקמות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂/95% אוויר למשך הלילה.
2. הכן 1 ליטר של DMEM על ידי הוספת 1 גרם של BSA (כיתה רדיואימונית), 0.11 גרם של פירובט נתרן, 0.58 גרם של L-גלוטמין, 3.2 גרם של סודיום ביקרבונט, 1.11 גרם של HEPES, ובקבוק 1 של DMEM ל 1 ליטר של מים מטוהרים במיוחד. הכן תמיסת מלאי גלוקוז של 1 M ב- DMEM. יש לשמור את שתי התמיסות על 4°C למשך הלילה.
3. בדוק את זרימת מערכת המיקרופריפוזיה יום לפני הניסוי. חברו את כל הצינוריות למחזיק שבב המכיל שבב ריק, כפי שמתואר באיור 2A-B. השתמש במים מטוהרים במיוחד כקולחים כדי לאשר קצב זרימה של 100 מיקרוליטר לדקה בקולט השברים.

3. הוספת סודות ל-DMEM (יום הניסוי)

1. הוסף 0.07 מ"ג / מ"ל אסקורבט ל- DMEM, והכן את הסוד במאגר DMEM + אסקורבט באמצעות מלאי גלוקוז של 1 M עבור המאגרים המכילים גלוקוז.
   הערה: אסקורבט משמש לייצוב אפינפרין על ידי מניעת חמצון שלו. אם אפינפרין אינו בשימוש, אסקורבט ניתן להשמיט מן DMEM.
2. סננו את הסוד פעמיים דרך מסנן נקבוביות בגודל 0.22 מיקרומטר, ובכל פעם השתמשו בפילטר טרי. חממו את התמיסות ל-37°C, ומדדו את הגלוקוז באמצעות גלוקומטר כדי לאשר את הריכוז הרצוי.

4. הגדרת מנגנון מיקרופריפיוז'ן

1. חממו את התא הסביבתי של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי לטמפרטורה של 37°C, וודאו שכל הדלתות סגורות והחדר שומר על טמפרטורה יציבה. הניחו את מחזיק השבב המכיל את השבב בתא כדי להתחמם. אמת את טמפרטורת השבב באמצעות אקדח אינפרא אדום.
   הערה: במקרה זה, התא הסביבתי מוגדר ל- 38.5 מעלות צלזיוס, מה שמאפשר לשבב להגיע ל- 37 מעלות צלזיוס.
2. חברו את כל הצינוריות למחזיק השבבים (כמתואר באיור 2A-B). קו שטיפה עם סוד קו הבסיס למשך 5 דקות. במחקר זה, הקו היה סמוק עם 2 mM גלוקוז (G 2). שנו את קרום מלכודת הבועות של הדה-בועה כל 8-10 ניסויים.

5. טעינת pseudoislets לתוך השבב

1. לפני טעינת השבב, צלם תמונת שדה בהיר ושדה כהה (הגדלה של פי 10) של הפסאודואיסטים שישמשו בניסוי לכימות הבא של מקבילות איים (IEQ).
   הערה: IEQ משמש לנרמל את הפרשת ההורמון לשינויים במספר האיון לאורך הניסויים. שלב זה יכול להיעשות גם יום לפני הניסוי.
2. שאפו כל נוזל נוסף מהחצי התחתון והעליון של השבב. החצי העליון של השבב מכיל אטמים המבטיחים אטימה נאותה של כל באר, ואילו החצי התחתון של השבב מכיל את הבארות עם כיסוי זכוכית מחובר. מראש להרטיב היטב אחד שבב עם 5 μL של DMEM. הקפידו לזלף סביב הקצוות החיצוניים של הבאר כדי להרטיב את הסדקים.
3. השתמש פיפטה רטובה מראש לאסוף 30-32 pseudoislets בנפח 23 μL, ולאט לאט לפזר pseudoislets למרכז הבאר בחלק התחתון של השבב. בדוק את קצה פיפטה עבור כל pseudoislets שאולי מחוברים.
4. השתמש בקצה העמסת ג'ל כדי לתמרן בעדינות את pseudoislets למרכז הבאר. זה מבטיח כי המספר המרבי של pseudoislets יילכדו בשדה ראייה.
5. צלם תמונה של pseudoislets בשבב על הסטריאוסקופ. ספירה זו תשמש להתאמת IEQ המחושב עבור כל אובדן פסאודואיסלט במהלך תהליך זה.
   1. אם כל הפסאודואים משלב 5.3 אינם נטענים לתוך השבב, התאם את IEQ בהתאם. לדוגמה, אם 30 pseudoislets הם דמיינו עכשיו אבל 32 היו חזותית בשלב 5.1, לחשב את IEQ על התמונות משלב 5.1 ולאחר מכן להכפיל ב 30/32.
6. הניחו את תחתית השבב במחזיק השבב. מניחים בזהירות את החלק העליון של השבב עם האטם הירוק כלפי מטה.
7. תוך כדי החזקת השבב במקומו, סגור בעדינות את מחזיק השבב כדי להדק את השבב יחד. נסו לא להפעיל לחץ מוגזם על השבב במהלך תהליך זה, שכן פעולה זו תעקור את הנוזל הכלול בבאר ועלולה להוביל לאובדן פסאודואיסלט. הימנעו מהחדרת בועות אוויר לבאר.

6. הדמיה סינכרונית של תאים חיים ומיקרופריפוזיה

1. מעבירים את הסוד, המשאבה והשבב שבמחזיק לתא הסביבתי המותאם למיקרוסקופ הקונפוקלי. כוונו את צינורות השטף אל מחוץ לתא אל קולט השברים.
   1. הכניסו את החוצצים לצינורות חרוטיים בנפח 15 מ"ל עם פתחים שנקדחו בכובעיהם. חורים אלה מונעים מצינור האיסוף להיסחף אל מחוץ לצינור.
   2. בעת הברגת הצינור לתוך de-bubbler, להפריד את האגוז ואת ferrule, ולאחר מכן להבריג לתוך de-bubbler. פעולה זו מונעת את פיתול הקו.
2. הגדר את אספן השברים כך שיסובב כל 2 דקות. טען את המספר המתאים של צינורות לתוך אספן השברים, תוך התחשבות בשטיפות ובשברים ניסיוניים. עבור ניסויים אלה נעשה שימוש ב-15 צינורות שטיפה (כביסה כוללת של 30 דקות) וב-28 צינורות לאיסוף שברים.
3. הפעל את המשאבה כדי לספק את התווך הבסיסי (המכיל את ריכוז הגלוקוז הבסיסי) ב- 100 μL / min (איסוף של 2 דקות בקצב זרימה של 100 μL / min מביא ל- 200 μL של קולחים לכל צינור שבר). קצב זרימה זה נבחר כדי להגביל את הלחץ העצום על הפסאודואיסטים ולמנוע תנועה משמעותית של פסאודואיסלט במהלך ההדמיה החיה.
   1. בזמן שהנוזל זורם דרך המנגנון, שימו לב לדברים הבאים:
      1. שימו לב לטיפות בקצה פיה של אספן השברים, המציינות זרימה דרך המערכת.
      2. שימו לב לירידות בשטף מהמערכת; אם יש <200 μL בצינורות האיסוף, הדבר מצביע על כך שייתכן שיש סתימה או דליפה במערכת. ראו טבלה 2 לקבלת רשימה של הגורמים האפשריים לירידה בנפח הקולחים, תמיסות וטיפים למניעה.
4. ברגע שיש זרימה בינונית קבועה מצינור השטף, סובב את ראש אספן השברים כדי לחלק לתוך הצינורות, והפעל את קולט השברים. אספו את 15 השברים הראשונים (30 דקות) ככביסה כדי לאפשר לפסאודואיסטים להתאזן. השתמש ב-15 השברים הראשונים הללו כדי להבטיח זרימה בינונית רציפה ומדויקת דרך המערכת. השליכו את השברים האלה לאחר מכן.
5. במהלך 30 דקות השטיפה, הגדר את המיקרוסקופ להדמיית תאים חיים על פי הפרמטרים הבאים: עדשה אובייקטיבית: U Plan Fluorite 20x עם זום 1x; תעלות פלואורסצנטיות: EGFP (פליטה = 510 ננומטר, אורך גל לייזר = 488, אורך גל גילוי = 500-600 ננומטר); סדרת זמן: התמונה נרכשת כל 2 שניות לכל הניסוי (כלומר, 56 דקות); מהירות דגימה: 2 μs / pixel.
   1. זהה את החלק התחתון של pseudoislets בשדה הראייה ולהתאים את מישור המוקד ל 15 מיקרומטר מעל מיקום זה. זוהי המסגרת שתשמש לאורך כל ניסוי ההדמיה.
6. לאחר השלמת הכביסה בת 30 הדקות, התחל באיסוף שברים ורכישת תמונות.
   הערה: יש לעשות את כל המאמצים כדי לזהות ולתקן בעיות כלשהן לפני שלב זה. ברגע שאיסוף הנתונים מתחיל, כל הפסקה בניסוי או חשיפה עודפת למפרישים עלולה להשפיע לרעה על התוצאות.
7. המשך perifusing pseudoislets עם מדיום הבסיס למשך אוסף הבסיס הראשון, איסוף השפכים לתוך צינורות 1.5 מ"ל. העבר את הצינור מהמאגר הבסיסי באופן ידני לצינור חיץ הגירוי החדש כאשר הזמן מתאים לניסוי.
   1. רצף מיקרופריפוזיה סטנדרטי מוצג בטבלה 3.
   2. לאחר איסוף ~ 10 שברים, מניחים את כל השברים במקרר 4 מעלות צלזיוס עד סוף הניסוי כדי למנוע את התפרקות ההורמונים, במיוחד גלוקגון.
   3. המשך לעקוב אחר זרימת המערכת לאורך כל הניסוי על ידי בדיקת נפח הקולחים בכל צינור.
8. לאחר השלמת הניסוי, חזור למדיום הבסיסי, ואפשר למשאבה להמשיך לפעול במשך 5 דקות כדי לשטוף את הגירוי עם מדיום הבסיס (במקרה זה, 2 מילימטר גלוקוז).
9. עצור את המשאבה, ונתק את צינור מחזיק השבב במנטרל הבועות ובקולט השברים כדי להסיר את מחזיק השבב מתא הסביבה. סגור את כל הדלתות לאחר הסרת השבב כדי לשמור על הטמפרטורה.
10. אחסנו את הפריפוזטים בטמפרטורה של -80°C לניתוח הורמונלי לאחר מכן.

7. מיצוי אתנול חומצה פסאודואיסלט

1. פתח בזהירות את מחזיק השבב והרם את החלק העליון של השבב. השתמש פיפטה ומיקרוסקופ benchtop כדי לבחור pseudoislets מתוך הבאר ולהעביר אותם צינור 1.5 מ"ל. ודא את האוסף של כל pseudoislets באמצעות מיקרוסקופ benchtop במידת הצורך.
   1. צלם תמונה סופית של הפסאודואיסטים בשבב לפני ההסרה מהבאר כדי להתאים את IEQ תמצית האיון, בדומה לשלב 5.5.
2. יש לשטוף פעמיים עם 500 מיקרוליטר של PBS. סובבו את הפסאודואיסלטים במשך דקה אחת במהירות של 94 x גרם בין כל כביסה, ושאפו לרדת מהסופרנטנט.
3. לאחר הסרת הכביסה האחרונה, להוסיף 200 μL של אתנול חומצה (5.5 מ"ל של 95% אתנול + 50 μL של 12 N HCl). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
4. למחרת, סחררו את התמציות במשך 10 דקות בטמפרטורה של 15,989 x גרם ו-4°C. Aliquot 45 μL לתוך שלושה צינורות חדשים. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C לניתוח תכולת הורמונים. כחלופה לנרמול הפרשת ההורמון ל- IEQ, ניתן לנרמל את הפרשת ההורמון גם לתכולת ההורמון המדומה הנמדדת מהתמציות.

8. ניסויים נוספים וניקוי

1. חזור על שלבים 5-7 עם קבוצות עוקבות של פסאודואיסטים כדי להשיג שכפולים טכניים נוספים.
2. לאחר סיום כל ניסויי המיקרופריפיוז'ן, העבירו 10% אקונומיקה דרך השבב והצינור למשך 5 דקות ולאחר מכן מים מטוהרים במיוחד למשך 30 דקות כדי לחטא את הצינור.

9. ניתוח נתונים

הערה: הדמיה של תאים חיים בוצעה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. התמונות נותחו באמצעות חבילת תוכנת הדמיה המשויכת למיקרוסקופ. להלן הנחיות כלליות, אך עשויות להשתנות בהתאם ליצרן המיקרוסקופ ולתוכנה לרכישת תמונות.

1. קביעת סך כל שווי האי (IEQ) לנורמליזציה של נתונים
   1. פתח את התוכנה ולחץ על הכרטיסייה רכישה בפינה השמאלית העליונה של החלון. צריבת אצווה בכל תמונות השדה הכהה על-ידי בחירה בפונקציה צריבת אצווה במנהל המאקרו (הצג כלי > Windows > מנהל המאקרו).
      1. כדי לצרוב תמונות מרובות בבת אחת, לחץ על הלחצן Toggle Batch Mode לפני לחיצה על לחצן הפעל בתוך מנהל המאקרו. בצע את ההוראות שעל המסך לבחירת מיקום תמונת המקור ומיקום היעד עבור התמונות הצרובות. לסוג קובץ התמונה, בחרו Tagged Imagine File Format (*.tif).
   2. עבור מדידת IEQ, פתח את הגרסה הצרובה של תמונת השדה הכהה פי 10 שצולמה בשלב 5.1. לחץ על הכרטיסייה ספירה ומדידה בחלק העליון, ובחר את ידני HSV סף כפתור בצד שמאל.
      1. השתמש בפונקציית הטפטפת כדי להוסיף/להסיר את האזור החיובי (באדום) עד שכל פסאודואיסלט יסומן באדום, מבלי להתרחב מעבר לגבול הפסאודואיסלט. לחץ על ספירה ומדידה.
   3. השתמש בפונקציות הפיצול האוטומטי או הפיצול הידני כדי לפצל את הפסאודואיסטים שחוברו יחד.
      1. כדי לפצל ידנית את הפסאודו-איים, בחר את פונקציית הפיצול הידני, לחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי כדי לצייר קו המפריד בין הפסאודואיסטים ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להשלים את השורה. כדי לפצל אוטומטית, בחר את פונקציית הפיצול האוטומטי ולחץ על הפסאודואים המקובצים של עניין. אשר את הפיצול האוטומטי הנכון לאחר מכן.
   4. בתמונות שנשרפו באצווה, סרגל קנה המידה וטקסט ההגדלה עשויים להיות מסומנים כחיוביים. מחק אובייקטים אלה לקבלת ספירה מדויקת על-ידי הדגשת הטקסט וסרגל קנה המידה באמצעות העכבר והקשה על מקש Delete keyboard .
   5. הפעל וכבה את המסנן כדי לוודא שכל הפסאודואיסטים נספרים. ניתן לפתוח את הקובץ גם מחוץ לתוכנית לצורך הצלבה. כשתסיים, לחץ על ייצוא ל- Excel.
   6. פתח את הגיליון האלקטרוני ושנה אותו באופן הבא.
      1. מחק את פרטי הספירה, הממוצע והמיון בחלק התחתון. מיין את האובייקטים לפי הקוטר הממוצע שלהם. הוסף עמודה אחרי הקוטר הממוצע, ותן לעמודה את השם "ספירת פסאודואיסלט".
      2. ספירת האיונים נקבעת על ידי מספר הפסאודואיסטים בעלי הקטרים הממוצעים הנמצאים בכל מדד שמתחתיו. הכפל את מספר הפסאודו-islets לכל מדד בגורם ההמרה המתאים של IEQ, וסכם ערכים אלה כדי לקבוע את IEQ הכולל. בצע את חישובי IEQ על התמונות שנרכשו לפני כל ניסוי. השתמש באינדקסים הבאים ובגורמי ההמרה של IEQ:
         1-49 מיקרומטר : × 0.167
         50-100 מיקרומטר : × 0.667
         101-150 מיקרומטר : × 1.685
         151-200 מיקרומטר: × 3.500
         201-300 מיקרומטר : × 6.315
         301-350 מיקרומטר: × 10.352
      3. לקבלת גיליון אלקטרוני לדוגמה לקביעת ספירות IEQ, ראה קובץ משלים 1.
2. כימות הדמיה של תאים חיים בתוכנה
   1. פתח את הקובץ הרצוי ( .oir) ב- cellSens.
   2. הגדר את אזורי העניין (ROIs) באופן הבא.
      1. השתמש בכלי השרטוט כדי לייעד את החזר ההשקעה (כלומר, כל פסאודואיון). אם אתה משתמש באפשרות הציור ביד חופשית, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לסגור את הצורה.
      2. סמן את כל החזר ההשקעה באמצעות מחוג החץ וגרירתו כדי להקיף את כל החזר ההשקעה בתמונה. כאשר כל החזר ההשקעה מסומן, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר המר להחזר השקעה דינמי לאורך זמן
      3. הפעל את קובץ XYT כדי לוודא שההחזר על ההשקעה מדויק לאורך זמן. אם החזר ההשקעה אינו מדויק בתקופה מסוימת, תקן את גודלו/מיקומו באותה תקופה. התוכנה תתאים בהדרגה את הגודל/מיקום של החזר ההשקעה לאורך זמן כדי להתאים לשינויים אלה. חזור על שלבים אלה עד שהחזר ההשקעה יהיה מדויק לאורך כל ניסוי ההדמיה.
   3. בצע מדידות עוצמה על כל החזר השקעה באופן הבא.
      1. בסרגל הכלים, לחץ על Measure Intensity Profile. הדגש את החזר ההשקעה כדי לנתח; השתמש ב- Shift + לחיצה כדי לבחור החזר השקעה מרובים.
         הערה: בעוד שקבצים מרובים עשויים להיות פתוחים בכל פעם בתוכנה, נתח רק את החזר ההשקעה מקובץ אחד בכל פעם.
      2. כדי להתחשב ברעשי רקע, בחרו ערך קבוע לחיסור מכל ערך עוצמה, או הקצו החזר השקעה אחד כרקע. לחץ על ביצוע.
      3. בסרגל הכלים פרופיל עוצמה , לחץ על ייצוא ל- Excel כדי לייצא את הנתונים.
      4. נרמל את כל נקודות הנתונים לממוצע העוצמות שנמדדו בין 7-8 דקות (כלומר, הדקה האחרונה של הפריפוזיה הבינונית הבסיסית הראשונה). ערכים מנורמלים אלה בכל נקודת זמן מוגדרים כעוצמת cADDis היחסית. לקבלת גיליון אלקטרוני לדוגמה של ניתוח ונורמליזציה של נתוני הדמיה, ראה קובץ משלים 2.
3. מדדו את הפרשת ההורמונים בכל שבר ותמצית איון. בניסויים אלה נמדדו ריכוזי אינסולין וגלוקגון על ידי ELISA. נרמל את הפרשת ההורמון בכל שבר לנפח הפסאודואיסלט באמצעות מדידות IEQ שנקבעו בשלב 9.1 או לפי תכולת הורמון החילוץ.

תוצאות

פסאודואיסטים אנושיים המבטאים ביוסנסורים נוצרו באמצעות העברה אדנו-ויראלית של מבנים המקודדים את cAMP biosensor cADDis (איור 1A). איור 1B מראה את הצבירה מחדש של תאי איון אנושי מותמרים לאורך זמן, כאשר פסאודואיסטים שנוצרו במלואם נצפו לאחר 6 ימי תרבית. התאים החלו להראות...

Discussion

השילוב של מערכת מיקרופריפוזיה, פסאודואיסטים המבטאים חיישנים ביולוגיים ומיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר מאפשר הערכה סינכרונית של אירועי איתות תוך תאיים ופרופילי הפרשת הורמונים דינמיים. מערכת המיקרופריפוזיה הדינמית יכולה לספק סדרה של גירויים מוגדרים היטב לפסאודואיסטים ומאפשרת איסוף קול?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad-CMV-cADDis	Welgen	Not applicable
0.01” FEP tubing	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubes	Any	Any
10 μm PTFE filter	Cole-Parmer	SK-21940-41	Change every 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070	Enriched-CMRL Media Component
190 proof Ethanol	Decon labs	2816	Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement	Gibco	35050061	Enriched-CMRL Media Component
Ascorbate	Sigma	A5960	DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7888	DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA 96-well Microplates	Perkin Elmer	6055330
cellSens analysis software	Olympus	v3.1	Software used for data analysis
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Enriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528	Glucose Buffer Component
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamber	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	12306C	Enriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Glucagon Kit HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Any	Any	Acid Ethanol Component
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium Supplement	Cell Dynamics	M1019	iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulin ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)	Sigma	I5879	Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscope	Olympus	FV3000
L-Glutamine	Sigma	G8540	DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)	University of Miami	FP-3W
Microchip holder	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector	Biorad	7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tips	Any	Any
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump	Instech	P720
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	Wash Islets
Sarstedt dishes	Sarstedt	depends on dish diameter
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6014	DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)	Millipore	SCGP00525	Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component