بروتوكول فحص القص لتحديد خصائص المواد أحادية الخلية

Summary

يحدد هذا البروتوكول القياس الكمي للخصائص الميكانيكية لخطوط الخلايا السرطانية وغير السرطانية في المختبر. يمكن أن تعمل الاختلافات المحفوظة في ميكانيكا الخلايا السرطانية والطبيعية كعلامة حيوية قد يكون لها آثار في التشخيص والتشخيص.

Abstract

الميكانيكا الحيوية غير المنتظمة هي السمة المميزة لبيولوجيا السرطان الخاضعة لدراسة مستفيضة. الخواص الميكانيكية للخلية مماثلة لتلك الخاصة بالمادة. مقاومة الخلية للإجهاد والإجهاد ، ووقت استرخاءها ، ومرونتها كلها خصائص يمكن اشتقاقها ومقارنتها بأنواع أخرى من الخلايا. يسمح تحديد الخواص الميكانيكية للخلايا السرطانية (الخبيثة) مقابل الخلايا الطبيعية (غير الخبيثة) للباحثين بالكشف عن الأساسيات الفيزيائية الحيوية لهذا المرض. في حين أنه من المعروف أن الخواص الميكانيكية للخلايا السرطانية تختلف باستمرار عن الخواص الميكانيكية للخلايا الطبيعية ، إلا أنه لا يوجد إجراء تجريبي قياسي لاستنتاج هذه الخصائص من الخلايا في الثقافة.

تحدد هذه الورقة إجراء لتحديد الخواص الميكانيكية للخلايا المفردة في المختبر باستخدام مقايسة قص السوائل. يتضمن المبدأ الكامن وراء هذا الفحص تطبيق إجهاد قص السوائل على خلية واحدة ومراقبة التشوه الخلوي الناتج بصريا بمرور الوقت. يتم بعد ذلك توصيف الخواص الميكانيكية للخلية باستخدام تحليل ارتباط الصورة الرقمية (DIC) وتركيب نموذج لزج مرن مناسب للبيانات التجريبية الناتجة عن تحليل DIC. بشكل عام ، يهدف البروتوكول الموضح هنا إلى توفير طريقة أكثر فعالية واستهدافا لتشخيص السرطانات التي يصعب علاجها.

Introduction

تتيح دراسة الاختلافات الفيزيائية الحيوية بين الخلايا السرطانية وغير السرطانية فرصا تشخيصية وعلاجية جديدة¹. إن فهم كيفية مساهمة الاختلافات في الميكانيكا الحيوية / علم الأحياء الميكانيكي في تطور الورم ومقاومة العلاج سيكشف عن طرق جديدة للعلاج الموجه والتشخيص المبكر².

في حين أنه من المعروف أن الخواص الميكانيكية للخلايا السرطانية تختلف عن الخلايا الطبيعية (على سبيل المثال ، مرونة اللزوجة في غشاء البلازما والغلاف النووي)³،⁴،^{5 ،} إلا أن الطرق القوية والقابلة للتكرار لقياس هذه الخصائص في الخلايا الحية غير موجودة⁶. تستخدم طريقة مقايسة القص لتحديد الخواص الميكانيكية للخلايا عن طريق إخضاع الخلايا المفردة لإجهاد القص السائل وتحليل استجاباتها الفردية ومقاومتها للإجهاد المطبق³،⁴،⁵،⁷،^8،9. على الرغم من استخدام العديد من الطرق والتقنيات لتوصيف الخواص الميكانيكية للخلايا المفردة ، إلا أنها تميل إلى التأثير على خصائص مادة الخلية عن طريق i) تثقيب / إتلاف غشاء الخلية بسبب عمق المسافة البادئة ، أو هندسة الطرف المعقدة ، أو تصلب الركيزة المرتبط بمجهر القوة الذرية (AFM) ^10،11 ، ii) إحداث تلف ضوئي خلوي أثناء الاصطياد البصري^{12 ، 13} ، أو iii) إحداث حالات إجهاد معقدة مرتبطة بشفط الماصة^{الدقيقة 14,15}. ترتبط هذه التأثيرات الخارجية بشكوك كبيرة في دقة قياسات مرونة لزوجة الخلية⁶،^16،17.

لمعالجة هذه القيود ، توفر طريقة فحص القص الموصوفة هنا نهجا بسيطا ويمكن التحكم فيه بدرجة كبيرة لمحاكاة التدفق الفسيولوجي في الجسم دون التأثير على خصائص المواد الخلوية في العملية. تمثل إجهادات قص السوائل في هذا الفحص ضغوطا ميكانيكية تعاني منها الخلايا في الجسم إما عن طريق السوائل داخل الخلالي للورم أو في الدم أثناء الدورة الدموية¹⁸،^19،20. علاوة على ذلك ، تعزز ضغوط السوائل هذه السلوكيات الخبيثة المختلفة في الخلايا السرطانية ، بما في ذلك التقدم والهجرة وورم خبيث وموت الخلايا¹⁹،²¹،^22،23 والتي تختلف بين الخلايا السرطانية وغير السرطانية. علاوة على ذلك ، فإن السمات الميكانيكية المتغيرة للخلايا السرطانية (أي أنها غالبا ما تكون "أكثر ليونة" من الخلايا الطبيعية الموجودة داخل نفس العضو) تسمح لها بالاستمرار في البيئات الدقيقة المعادية للورم ، وغزو الأنسجة الطبيعية المحيطة ، والانتقال إلى مواقع بعيدة²⁴،^25،26. من خلال خلق بيئة بيولوجية زائفة حيث تعاني الخلايا من مستويات فسيولوجية من إجهاد قص السوائل ، يتم تحقيق عملية ذات صلة من الناحية الفسيولوجية وليست مدمرة للخلية. تسمح لنا الاستجابات الخلوية لضغوط قص السوائل المطبقة هذه بتوصيف الخواص الميكانيكية للخلية.

يقدم هذا البحث بروتوكول مقايسة القص للدراسة المكثفة للخصائص الميكانيكية وسلوك الخلايا السرطانية وغير السرطانية تحت إجهاد القص المطبق. تستجيب الخلايا للقوى الخارجية بطريقة مرنة ولزجة وبالتالي يمكن أن تكون مثالية كمادة لزجة^{مرنة 3}. يتم تصنيف هذه التقنية إلى: (i) زراعة الخلايا للخلايا المفردة المشتتة ، (ii) التطبيق المتحكم فيه لإجهاد قص السوائل ، (iii) التصوير في الموقع ومراقبة السلوك الخلوي (بما في ذلك مقاومة الإجهاد والتشوه) ، (iv) تحليل سلالة الخلايا لتحديد مدى التشوه ، و (v) توصيف الخصائص اللزجة المرنة للخلايا المفردة. من خلال استجواب هذه الخصائص والسلوكيات الميكانيكية ، يمكن تقطير البيولوجيا الميكانيكية الخلوية المعقدة إلى بيانات قابلة للقياس الكمي. يسمح البروتوكول الذي يحدد هذه الطريقة بفهرسة ومقارنة أنواع الخلايا الخبيثة وغير الخبيثة المختلفة. إن القياس الكمي لهذه الاختلافات لديه القدرة على إنشاء مؤشرات حيوية تشخيصية وعلاجية.

Protocol

1. التحضير لمقايسة القص أحادية الخلية

1. زراعة الخلايا
   1. بذر ما يقرب من 50000 خلية مفردة معلقة في طبق بتري 35 مم × 10 مم يحتوي على 2 مل من وسائط الاستزراع.
      ملاحظة: دوامة الخلايا العالقة قبل البذر لتفكيك مجاميع الخلايا.
   2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية والسماح ما بين 10 إلى 48 ساعة لربط الخلية وتكوين البروتين الهيكلي الخلوي الكامل.
      ملاحظة: ضع في اعتبارك مدة التعلق الخلوي ، بالإضافة إلى معدلات الانتشار والنمو ، لضمان نمو الخلايا وتعلقها بشكل كاف مع تجنب تراكم الخلايا. تختلف هذه المعلمات باختلاف نوع الخلية.

2. تجربة مقايسة القص

1. تحضير وسائط التدفق اللزج لمقايسة القص
   1. لضمان وسائط تدفق لزجة قليلا (0.015-0.02 باسكال ثانية) ، قم بقياس وإضافة 0.05٪ بالوزن من ميثيل سلولوز غير سام وغير مسبب للحساسية (4 باسكال ثانية) إلى وسائط الاستزراع.
   2. لضمان مزيج متجانس ، سخن وسائط الاستزراع الأساسية لمدة ~ 10-20 دقيقة عند درجة حرارة ~ 60-70 °C باستخدام محرك مغناطيسي / لوح تسخين. أثناء تحريك الوسائط باستمرار ، أضف الميثيل سلولوز برفق بحيث يتشتت بسرعة ، لتجنب تخثر جزيئات ميثيل سلولوز. اسمح لهذه العملية بالاستمرار لمدة ~ 15-24 ساعة لضمان حل واضح للوسائط + السليلوز.
      ملاحظة: تجنب التسخين المفرط للمحلول.
   3. لقياس لزوجة وسائط التدفق ، اختبر ~ 0.5-1 مل من وسائط التدفق التمثيلية باستخدام مقياس ريومتر. من القراءة ، حدد لزوجة السائل واستخدم هذه القيمة لتمثيل لزوجة وسط مائع القص (μ) لحساب إجهاد القص باستخدام المعادلة (2).
2. إعداد جهاز القص
   1. قم بإعداد نظام فحص القص للمحاقن المزدوجة (60 مل أو 100 مل) المتصل بمضخة حقنة قابلة للبرمجة لتسريب وسحب وسائط الثقافة اللزجة (الشكل 1).
   2. قم بتوصيل كلا المحقنتين بغرفة التدفق عبر موصلات أنابيب وأنابيب مقاس 1/16 بوصة.
   3. اربط حشية مطاطية لتوفير تدفق موحد متحكم فيه على خلايا مفردة على طول مسار التدفق (الشكل 1). تأتي الحشية المطاطية بأحجام مختلفة اعتمادا على ملف تعريف التدفق المراد تحقيقه (رقائقي أو مضطرب) ومنطقة المراقبة المرغوبة (على سبيل المثال ، طول 22.5 مم ، عرض 2.5 مم ، وارتفاع 0.254 مم) (الشكل 1).
   4. قم ببرمجة المضخة لضخ وسحب حجم معين من السوائل (على سبيل المثال ، 60 مل) بمعدل معين (على سبيل المثال ، 1 مل / دقيقة) وحدد المحاقن المقابلة (على سبيل المثال ، 60 مل).
      ملاحظة: ضع في اعتبارك الحد الأقصى للإعدادات المسبقة لحجم التسريب والسحب لتجنب التشويش أو العطل. استخدم المعادلة (2) لحساب معدل قص المضخة المطلوب (بافتراض أن الإجهاد واللزوجة المطلوبين معروفان).
3. إعداد ما قبل القص
   1. املأ المحقنة بوسائط التدفق اللزج المعدة.
   2. قم بتوصيل المحقنة المملوءة ب 60 أو 100 مل (أو حسب الحاجة) من وسائط التدفق اللزجة ، ومحقنة فارغة سعة 60 مل في مواقعها على مضخة المحقنة القابلة للبرمجة. عبر موصلات الأنابيب والأنابيب ، قم بتوصيل كلا المحاقن بغرفة التدفق.
   3. لضمان سهولة التعرف على الخلايا المفردة والاتصال المثبت بين غرفة التدفق وطبق بتري ، قم بتوصيل الحشية المطاطية بغرفة التدفق.
   4. نضح وسائط زراعة الخلايا من طبق بتري الذي يحتوي على الخلايا محل الاهتمام.
   5. اغسل الخلايا الميتة والخلايا المرتبطة بشكل فضفاض باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
   6. نضح برنامج تلفزيوني.
   7. أدخل وثبت غرفة التدفق والحشية المطاطية (~ 34 مم × 9 مم) على طبق بتري (35 مم × 10 مم) الذي يحتوي على الخلايا المرفقة.
   8. ضع غرفة تدفق الموائع الدقيقة المجهزة + الخلايا على طبق مثقف على مجهر مقلوب ، مع هدف مجهر مرتفع بما يكفي للحصول على صور عالية الجودة بقيم بكسل عالية (عادة بين 40x و 63x تكبير) وشاشة عرض.
   9. حدد خيار الصورة الحية (الفاصل الزمني في بعض البرامج) من برنامج المجهر على شاشة العرض. تأكد من أن برنامج المجهر على جهاز الكمبيوتر لديه وظيفة t (الفاصل الزمني) أو يمكنه التقاط تسجيلات الفيديو.
   10. ركز هدف المجهر ، مما يضمن التباين الكافي وحواف الخلايا المميزة. هذا ضروري لتحليل الصورة بعد القص. حرك مرحلة المجهر للتأكد من أن الخلايا مرئية بوضوح على شاشة العرض وأنها صور حية.
   11. حدد خلية أو عدة خلايا مميزة داخل مسار التصوير / التدفق لغرفة التدفق المجهزة + طبق بتري (المنطقة / المسار الذي تم إنشاؤه بواسطة تركيب الحشية في غرفة التدفق).
4. القص والتصوير
   1. للحفاظ على تدفق موحد مستمر ، حدد معدلات ضخ وسحب مماثلة وتأكد من التدفق الصفحي للسائل ، عادة بين 1 مل / دقيقة و 5 مل / دقيقة. بالنسبة لأنظمة التدفق الصفحي المنخفض ، تأكد من أن عدد Re < 100 في Re من رينولد.
   2. انقر فوق تشغيل على مضخة القص لحقن وسحب سائل القص (الوسائط اللزجة المحضرة) بمعدل مستمر. تأكد من عدم وجود فقاعات أثناء ضخ السوائل ، لأن هذا قد يؤدي إلى ضغط خارجي غير محسوب على الخلايا.
   3. ابدأ في تسجيل مقطع فيديو بالنقر فوق تسجيل على برنامج المجهر قبل أن يتلامس سائل القص المشبع مع الخلية (الخلايا) ذات الأهمية تحت المجهر.
   4. استمر في التسجيل لمدة 7 دقائق ، أو طوال المدة المطلوبة للتعرض للإجهاد ، أو حتى تنفصل الخلية (الخلايا) ذات الأهمية عن قاع الطبق. انقر فوق إيقاف التسجيل على برنامج المجهر عند اكتمال التشغيل حسب الرغبة.
   5. احفظ التسجيل واستخرجه كملفات .tiff. على نحو مفضل ، استخراج الصور بمعدل 1 إطار في الثانية للتحليل السهل.

3. معالجة البيانات

1. إجراء ارتباط الصورة الرقمية (تحليل الصورة)
   1. إذا تم استخراج التسجيل من المجهر كملف فيديو ، فقم بتحويله إلى إطارات صور (يفضل .tiff تنسيق الملف).
   2. قم باستيراد الصور المشتقة من تسجيل مقايسة القص إلى برنامج Davis 10.1.2 (برنامج DIC) لتتبع حركة الهياكل المنقوشة بشكل طبيعي للخلية عن طريق تحديد موقع كل كتلة بكسل (مجموعة فرعية) من الصورة المرجعية في الصور الجديدة المعنية (الصور المشوهة) (الشكل 2).
   3. للحصول على ارتباط محسن ، استخدم حجم مجموعة فرعية يبلغ 31 × 31 بكسل ، وحجم خطوة (مسافة تشوه كل مجموعة فرعية) يبلغ 20 بكسل ، ومجموع خيار المسار التفاضلي ، الذي يتتبع تشوه صورة جديدة فيما يتعلق بالصورة الأخيرة. نتيجة هذا الارتباط هي مخطط وقت الإجهاد (الشكل 3) الذي يمكن تصديره كملف .csv لمزيد من التحليل في MATLAB.
   4. حدد منطقة الاهتمام لخلية مفردة مختارة. حدد النقاط العشوائية داخل الخلية المعينة لتعقب التشوه. بالنسبة لشكل غير منتظم، مثل الخلية، استخدم قناع مضلع لرسم خريطة هندسية للخلية.
   5. بعد التعيين ، اختر نقاطا محددة على الخلية (النواة أو السيتوبلازم) ليتم تحليلها بالنقر فوق إضافة مقياس إجهاد ورسم مقاييس إجهاد فردية في نقاط داخل الحدود الخلوية المحددة.
   6. انقر فوق تشغيل لبدء معالجة الإجهاد والحصول على بيانات الإجهاد مقابل الوقت.
   7. انقر نقرا مزدوجا (أو انقر بزر الماوس الأيمن) على مخطط وقت الإجهاد الذي تم إنشاؤه وحدد تصدير البيانات كجدول بيانات.

4. توصيف الخواص الميكانيكية

1. توصيف خاصية اللزوجة المرنة
   1. احفظ ملف .csv الذي يحتوي على بيانات وقت الإجهاد من برنامج DIC في مجلد منفصل لسهولة القراءة بواسطة MATLAB.
   2. قم بتشغيل MATLAB وانقر فوق علامة تبويب المحرر لفتح صفحة محرر لكتابة رمز يقرأ جدول البيانات ، خلية تلو الأخرى.
   3. قم بتغيير مسار MATLAB (مسار المجلد الذي يصل إلى ملف الاهتمام) للوصول إلى المجلد الذي يحتوي على البيانات المراد تحليلها ، على سبيل المثال ، المستخدمون / اسم المستخدم / سطح المكتب / البيانات.
   4. في صفحة محرر MATLAB ، قم بالوصول إلى بيانات جدول البيانات باستخدام الرمز المخصص. على سبيل المثال: a1 = xlsread ('data'، 'run1'، 'A4: A183')، حيث يمثل a1 المعرف، xlsread هي دالة MATLAB التي تقرأ ملف .csv (في هذه الحالة، كجدول بيانات)، والبيانات هي اسم الملف، وrun1 هو اسم الورقة، وA4: A183 هو نطاق البيانات ذات الأهمية في الخلية A لبيانات جدول البيانات المراد تحليلها. للحصول على ملاءمة كاملة ، قم بتحليل x و y (الوقت والإجهاد ، على التوالي). على سبيل المثال:
      a1 = xlsread ('data','run1','A4:A183');
      b1 = xlsread ('data','run1','B4:B183');
      A1 = x (الوقت) ، و B1 = Y (سلالة).
   5. في MATLAB ، انقر فوق التطبيقات | مجرب المنحنى | معادلة مخصصة. امسح المعادلة المخصصة التمثيلية وأدخل معادلة النموذج اللزج المرن [المعادلة (1)] ، حيث يمثل ε المتغير x ويمثل t المتغير y.
      (1)
      هنا ، يمثل ε الإجهاد ، σ يمثل إجهاد القص ، η₁ يمثل اللزوجة ، E يمثل المرونة ، t يمثل الوقت ، و τ يمثل وقت الاسترخاء ، والذي يميز الحد الأقصى للوقت اللازم للخلية للعودة إلى شكلها الأصلي بعد التشوه الأولي. يتم التعبير عنها ك τ = ، حيث η₂ هو مصطلح اللزوجة الثانوية ل dashpot الثاني (الشكل 4).
   6. إعادة تعيين متغيرات جديدة للمعلمات اللزجة المرنة داخل واجهة المعادلة المخصصة. (ε ، η₁ ، E ، σ ، t ، و τ = ) سيمثل (x و a و b و K و y و c) على التوالي. هنا ، x و y هما المتغيران المستقل والتابع ، على التوالي. يمكن تحديد إجهاد القص (σ) باستخدام المعادلة (2):
      (2)
      هنا ، يمثل μ لزوجة وسط مائع القص ، و Q هو معدل تدفق المضخة ، و w و h هما عرض وارتفاع قناة التدفق الموضحة في الشكل 1C ، على التوالي.
   7. انقر فوق تحديد البيانات لتحديد الوقت (a1) والإجهاد (b1) لكل مجموعة من البيانات.
   8. تأكد من تحديد خيار مربع الاحتواء التلقائي . يؤدي هذا إلى تشغيل الملاءمة تلقائيا عند تحديد البيانات (x و y).
   9. حدد طرق التركيب لتشديد شروط الحدود. انقر فوق خيارات متقدمة ضمن فئة الطرق وحدد المربعات الصغرى غير الخطية. ضمن قوي، حدد إيقاف، وضمن خوارزمية، حدد منطقة الثقة. اترك كل معلمة أخرى كما هي.
   10. تمثل المتغيرات الجديدة بعد التركيب (a و b و c) الخصائص اللزجة المرنة واللزوجة والمرونة ووقت الاسترخاء (η₁ ، E ، EQUAT) ، للخلية ، على التوالي (الشكل 5).
   11. ابحث عن قيمة مربع R عالية للملاءمة (R² > 80٪) للتأكد من أن إخراج البيانات يمكن اعتباره مناسبا حقيقيا للنموذج اللزج المرن (الشكل 3)

النتائج

بروتوكول مقايسة القص المقترن بتحليل التشوه باستخدام DIC ونموذج المرونة اللزجة ناجح في تحديد الخواص الميكانيكية لخلية واحدة في المختبر. تم اختبار هذه الطريقة على خطوط خلايا الإنسان والفئران ، بما في ذلك خلايا الثدي البشرية الطبيعية (MCF-10A) 3،⁴،⁹ ، وخلايا سرطان ا?...

Discussion

أنتجت طريقة فحص القص ، والتي تتضمن إنشاء بيئة ميكانيكية بيولوجية زائفة لمحاكاة تفاعل الخلايا مع البيئة الدقيقة الميكانيكية المحيطة واستجاباتها للضغوط الميكانيكية ، كتالوجا للخصائص الميكانيكية الخلوية ، التي تظهر أنماطها اللانمطية الفيزيائية المحفوظة بين خطوط الخلايا السرطانية

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL CULTURE
.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate	Corning	25-053-ci	For cellular detachment from substrate in cell culture
15 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	05-527-90
35 mm Petri dishes	Corning	430165
50 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	14-432-22
centrifuge	any		For sterile cell culture
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x	Corning	10-013-cv	Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells
gloves	any		For sterile cell culture
Heracell Vios 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51033770	For Incubation during cell culture
Hood	any		For sterile cell culture
micropipette	any		For sterile cell culture
micropipette tips	any		For sterile cell culture
Microscope	Leica/any		For sterile cell culture
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x	Corning	21-040-CM
pipetman	any		For sterile cell culture
pipette tips	any		For sterile cell culture
Precision GP 10 liquid incubator	Thermo Scientific	TSGP02
T25 flask	Corning	430639
T75 flask	Corning	430641U
SHEAR ASSAY
100 mL beaker	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
DMEM	Corning
Flow chamber + rubber gasket	Glycotech	31-001	Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes)
Hybrid Rheometer	HR-2 Discovery Hybrid Rheometer		For determination of shear fluid viscosity
magnetic stir bar	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
magnetic stir plate	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
methyl cellulose	any		To increase viscosity of DMEM in flow media
Syringe Pump	KD Scientific Geminin 88 plus	788088	For programming fluid infusion and withdrawal
syringes, tubing, and connectors			For shear apparatus setup
SOFTWARE
ABAQUS software	Simulia
Digitial Image Correlation software	LaVision, Germany	DAVIS 10.1.2
Imaging software	Leica/any microscope software
MATLAB	MATLAB	MATLAB_R2020B