بروتوكول فحص القص لتحديد خصائص المواد أحادية الخلية

Summary

يحدد هذا البروتوكول القياس الكمي للخصائص الميكانيكية لخطوط الخلايا السرطانية وغير السرطانية في المختبر. يمكن أن تعمل الاختلافات المحفوظة في ميكانيكا الخلايا السرطانية والطبيعية كعلامة حيوية قد يكون لها آثار في التشخيص والتشخيص.

Abstract

الميكانيكا الحيوية غير المنتظمة هي السمة المميزة لبيولوجيا السرطان الخاضعة لدراسة مستفيضة. الخواص الميكانيكية للخلية مماثلة لتلك الخاصة بالمادة. مقاومة الخلية للإجهاد والإجهاد ، ووقت استرخاءها ، ومرونتها كلها خصائص يمكن اشتقاقها ومقارنتها بأنواع أخرى من الخلايا. يسمح تحديد الخواص الميكانيكية للخلايا السرطانية (الخبيثة) مقابل الخلايا الطبيعية (غير الخبيثة) للباحثين بالكشف عن الأساسيات الفيزيائية الحيوية لهذا المرض. في حين أنه من المعروف أن الخواص الميكانيكية للخلايا السرطانية تختلف باستمرار عن الخواص الميكانيكية للخلايا الطبيعية ، إلا أنه لا يوجد إجراء تجريبي قياسي لاستنتاج هذه الخصائص من الخلايا في الثقافة.

تحدد هذه الورقة إجراء لتحديد الخواص الميكانيكية للخلايا المفردة في المختبر باستخدام مقايسة قص السوائل. يتضمن المبدأ الكامن وراء هذا الفحص تطبيق إجهاد قص السوائل على خلية واحدة ومراقبة التشوه الخلوي الناتج بصريا بمرور الوقت. يتم بعد ذلك توصيف الخواص الميكانيكية للخلية باستخدام تحليل ارتباط الصورة الرقمية (DIC) وتركيب نموذج لزج مرن مناسب للبيانات التجريبية الناتجة عن تحليل DIC. بشكل عام ، يهدف البروتوكول الموضح هنا إلى توفير طريقة أكثر فعالية واستهدافا لتشخيص السرطانات التي يصعب علاجها.

Introduction

تتيح دراسة الاختلافات الفيزيائية الحيوية بين الخلايا السرطانية وغير السرطانية فرصا تشخيصية وعلاجية جديدة¹. إن فهم كيفية مساهمة الاختلافات في الميكانيكا الحيوية / علم الأحياء الميكانيكي في تطور الورم ومقاومة العلاج سيكشف عن طرق جديدة للعلاج الموجه والتشخيص المبكر².

في حين أنه من المعروف أن الخواص الميكانيكية للخلايا السرطانية تختلف عن الخلايا الطبيعية (على سبيل المثال ، مرونة اللزوجة في غشاء البلازما والغلاف النووي)³،⁴،^{5 ،} إلا أن الطرق القوية والقابلة للتكرار لقياس هذه الخصائص في الخلايا الحية غير موجودة

Protocol

1. التحضير لمقايسة القص أحادية الخلية

1. زراعة الخلايا
   1. بذر ما يقرب من 50000 خلية مفردة معلقة في طبق بتري 35 مم × 10 مم يحتوي على 2 مل من وسائط الاستزراع.
      ملاحظة: دوامة الخلايا العالقة قبل البذر لتفكيك مجاميع الخلايا.
   2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية والسماح ما بين 10 إلى 48 ساعة لربط الخلية وتكوين البروتين الهيكلي الخلوي الكامل.
      ملاحظة: ضع في اعتبارك مدة التعلق الخلوي ، بالإضافة إلى معدلات الانتشار والنمو ، لضمان نمو الخلايا وتعلقها بشكل كاف مع تجنب تراكم الخلايا. تختلف هذه المعلمات باختلاف نوع الخلية.

2. تجربة مقايسة القص

1. تحضير وسائط التدفق اللزج ل....

النتائج

بروتوكول مقايسة القص المقترن بتحليل التشوه باستخدام DIC ونموذج المرونة اللزجة ناجح في تحديد الخواص الميكانيكية لخلية واحدة في المختبر. تم اختبار هذه الطريقة على خطوط خلايا الإنسان والفئران ، بما في ذلك خلايا الثدي البشرية الطبيعية (MCF-10A) 3،⁴،⁹ ، وخلايا سرطان ا?.......

Discussion

أنتجت طريقة فحص القص ، والتي تتضمن إنشاء بيئة ميكانيكية بيولوجية زائفة لمحاكاة تفاعل الخلايا مع البيئة الدقيقة الميكانيكية المحيطة واستجاباتها للضغوط الميكانيكية ، كتالوجا للخصائص الميكانيكية الخلوية ، التي تظهر أنماطها اللانمطية الفيزيائية المحفوظة بين خطوط الخلايا السرطانية

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL CULTURE
.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate	Corning	25-053-ci	For cellular detachment from substrate in cell culture
15 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	05-527-90
35 mm Petri dishes	Corning	430165
50 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	14-432-22
centrifuge	any		For sterile cell culture
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x	Corning	10-013-cv	Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells
gloves	any		For sterile cell culture
Heracell Vios 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51033770	For Incubation during cell culture
Hood	any		For sterile cell culture
micropipette	any		For sterile cell culture
micropipette tips	any		For sterile cell culture
Microscope	Leica/any		For sterile cell culture
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x	Corning	21-040-CM
pipetman	any		For sterile cell culture
pipette tips	any		For sterile cell culture
Precision GP 10 liquid incubator	Thermo Scientific	TSGP02
T25 flask	Corning	430639
T75 flask	Corning	430641U
SHEAR ASSAY
100 mL beaker	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
DMEM	Corning
Flow chamber + rubber gasket	Glycotech	31-001	Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes)
Hybrid Rheometer	HR-2 Discovery Hybrid Rheometer		For determination of shear fluid viscosity
magnetic stir bar	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
magnetic stir plate	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
methyl cellulose	any		To increase viscosity of DMEM in flow media
Syringe Pump	KD Scientific Geminin 88 plus	788088	For programming fluid infusion and withdrawal
syringes, tubing, and connectors			For shear apparatus setup
SOFTWARE
ABAQUS software	Simulia
Digitial Image Correlation software	LaVision, Germany	DAVIS 10.1.2
Imaging software	Leica/any microscope software
MATLAB	MATLAB	MATLAB_R2020B