Protocole de dosage de cisaillement pour la détermination des propriétés d’un matériau unicellulaire

Résumé

Ce protocole décrit la quantification des propriétés mécaniques des lignées cellulaires cancéreuses et non cancéreuses in vitro. Les différences conservées dans la mécanique des cellules cancéreuses et normales peuvent agir comme un biomarqueur qui peut avoir des implications dans le pronostic et le diagnostic.

Résumé

La biomécanique irrégulière est une caractéristique de la biologie du cancer qui fait l’objet d’études approfondies. Les propriétés mécaniques d’une cellule sont similaires à celles d’un matériau. La résistance d’une cellule au stress et à la tension, son temps de relaxation et son élasticité sont autant de propriétés qui peuvent être dérivées et comparées à d’autres types de cellules. La quantification des propriétés mécaniques des cellules cancéreuses (malignes) par rapport aux cellules normales (non malignes) permet aux chercheurs de découvrir davantage les fondements biophysiques de cette maladie. Bien que les propriétés mécaniques des cellules cancéreuses soient connues pour différer systématiquement des propriétés mécaniques des cellules normales, il n’existe pas de procédure expérimentale standard pour déduire ces propriétés à partir de cellules en culture.

Cet article décrit une procédure pour quantifier les propriétés mécaniques de cellules individuelles in vitro à l’aide d’un test de cisaillement fluide. Le principe derrière ce test consiste à appliquer une contrainte de cisaillement fluide sur une seule cellule et à surveiller optiquement la déformation cellulaire résultante au fil du temps. Les propriétés mécaniques des cellules sont ensuite caractérisées à l’aide de l’analyse de corrélation d’images numériques (DIC) et de l’ajustement d’un modèle viscoélastique approprié aux données expérimentales générées par l’analyse DIC. Dans l’ensemble, le protocole décrit ici vise à fournir une méthode plus efficace et ciblée pour le diagnostic des cancers difficiles à traiter.

Introduction

L’étude des différences biophysiques entre les cellules cancéreuses et non cancéreuses ouvre de nouvelles possibilités diagnostiques et thérapeutiques¹. Comprendre comment les différences en biomécanique/mécanobiologie contribuent à la progression tumorale et à la résistance au traitement révélera de nouvelles voies pour la thérapie ciblée et le diagnostic précoce².

Bien que l’on sache que les propriétés mécaniques des cellules cancéreuses diffèrent de celles des cellules normales (p. ex. viscoélasticité de la membrane plasmique et de l’enveloppe nucléaire)^3,4,5

Protocole

1. Préparation pour le test de cisaillement unicellulaire

1. Culture cellulaire
   1. Ensemencer environ 50 000 cellules simples en suspension dans une boîte de Petri de 35 mm x 10 mm contenant 2 ml de milieux de culture.
      REMARQUE : Vortex des cellules en suspension avant l’ensemencement pour briser les agrégats cellulaires.
   2. Incuber les cellules à 37 °C et laisser entre 10 et 48 h pour l’attachement cellulaire et la formation complète des protéines cytosquelettiques.
      REMARQUE: Tenez compte de la durée de l’attachement cellulaire, ainsi que des taux de prolifération et de croissance, pour assurer une croissance et une fixation ....

Discussion

La méthode de dosage par cisaillement, qui comprend la mise en place d’un environnement pseudo-mécanobiologique pour simuler l’interaction des cellules avec le microenvironnement mécanique environnant et leurs réponses aux contraintes mécaniques, a produit un catalogue de propriétés mécaniques cellulaires, dont les modèles montrent des atypies physiques conservées parmi les lignées cellulaires cancéreuses 3,4,5,7,8

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL CULTURE
.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate	Corning	25-053-ci	For cellular detachment from substrate in cell culture
15 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	05-527-90
35 mm Petri dishes	Corning	430165
50 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	14-432-22
centrifuge	any		For sterile cell culture
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x	Corning	10-013-cv	Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells
gloves	any		For sterile cell culture
Heracell Vios 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51033770	For Incubation during cell culture
Hood	any		For sterile cell culture
micropipette	any		For sterile cell culture
micropipette tips	any		For sterile cell culture
Microscope	Leica/any		For sterile cell culture
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x	Corning	21-040-CM
pipetman	any		For sterile cell culture
pipette tips	any		For sterile cell culture
Precision GP 10 liquid incubator	Thermo Scientific	TSGP02
T25 flask	Corning	430639
T75 flask	Corning	430641U
SHEAR ASSAY
100 mL beaker	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
DMEM	Corning
Flow chamber + rubber gasket	Glycotech	31-001	Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes)
Hybrid Rheometer	HR-2 Discovery Hybrid Rheometer		For determination of shear fluid viscosity
magnetic stir bar	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
magnetic stir plate	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
methyl cellulose	any		To increase viscosity of DMEM in flow media
Syringe Pump	KD Scientific Geminin 88 plus	788088	For programming fluid infusion and withdrawal
syringes, tubing, and connectors			For shear apparatus setup
SOFTWARE
ABAQUS software	Simulia
Digitial Image Correlation software	LaVision, Germany	DAVIS 10.1.2
Imaging software	Leica/any microscope software
MATLAB	MATLAB	MATLAB_R2020B