Протокол сдвигового анализа для определения свойств одноячеистого материала

Резюме

В этом протоколе описывается количественная оценка механических свойств раковых и нераковых клеточных линий in vitro. Консервативные различия в механике раковых и нормальных клеток могут выступать в качестве биомаркера, который может иметь значение для прогноза и диагностики.

Аннотация

Нерегулярная биомеханика является отличительной чертой биологии рака, подлежащей обширному изучению. Механические свойства ячейки аналогичны свойствам материала. Устойчивость клетки к стрессу и напряжению, время ее релаксации и ее эластичность — все это свойства, которые можно вывести и сравнить с другими типами клеток. Количественная оценка механических свойств раковых (злокачественных) и нормальных (незлокачественных) клеток позволяет исследователям глубже раскрыть биофизические основы этого заболевания. Хотя известно, что механические свойства раковых клеток постоянно отличаются от механических свойств нормальных клеток, стандартная экспериментальная процедура для определения этих свойств из клеток в культуре отсутствует.

В этой статье описывается процедура количественной оценки механических свойств отдельных клеток in vitro с использованием анализа сдвига жидкости. Принцип, лежащий в основе этого анализа, заключается в приложении напряжения сдвига жидкости к одной ячейке и оптическом мониторинге результирующей клеточной деформации с течением времени. Механические свойства ячеек впоследствии характеризуются с помощью анализа цифровой корреляции изображений (DIC) и подгонки соответствующей вязкоупругой модели к экспериментальным данным, полученным в результате ДВС-анализа. В целом, протокол, изложенный здесь, направлен на обеспечение более эффективного и целенаправленного метода диагностики трудно поддающихся лечению видов рака.

Введение

Изучение биофизических различий между раковыми и нераковыми клетками открывает новые диагностические и терапевтические возможности¹. Понимание того, как различия в биомеханике/механобиологии способствуют прогрессированию опухоли и резистентности к лечению, откроет новые возможности для таргетной терапии и ранней диагностики².

Хотя известно, что механические свойства раковых клеток отличаются от нормальных клеток (например, вязкоупругость плазматической мембраны и ядерной оболочки)^3,4,5, надежные и воспроизводимые методы изме....

протокол

1. Подготовка к одноклеточному сдвиговому анализу

1. Клеточная культура
   1. Засейте около 50 000 суспендированных одиночных клеток в чашку Петри размером 35 мм x 10 мм, содержащую 2 мл питательной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед посевом встряхните взвешенные ячейки, чтобы разбить агрегаты клеток.
   2. Инкубируйте клетки при 37 ° C и подождите от 10 до 48 часов для прикрепления клеток и полного образования белка цитоскелета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывайте продолжительность клеточного прикрепления, а также скорость пролиферации и роста, чтобы обеспечить адекватный клеточный рост и прикрепление, избегая при этом клеточной агрегации. Эти параметры ....

Результаты

Протокол анализа сдвига в сочетании с анализом деформации с использованием DIC и вязкоупругой модели успешно определяет механические свойства одной ячейки in vitro. Этот метод был протестирован на клеточных линиях человека и мышей, включая нормальные клетки молочной железы человека (.......

Обсуждение

Метод сдвигового анализа, который включает в себя создание псевдомеханобиологической среды для моделирования взаимодействия клеток с окружающим механическим микроокружением и их реакции на механические нагрузки, позволил создать каталог клеточных механических свойств, закономерн?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL CULTURE
.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate	Corning	25-053-ci	For cellular detachment from substrate in cell culture
15 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	05-527-90
35 mm Petri dishes	Corning	430165
50 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	14-432-22
centrifuge	any		For sterile cell culture
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x	Corning	10-013-cv	Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells
gloves	any		For sterile cell culture
Heracell Vios 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51033770	For Incubation during cell culture
Hood	any		For sterile cell culture
micropipette	any		For sterile cell culture
micropipette tips	any		For sterile cell culture
Microscope	Leica/any		For sterile cell culture
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x	Corning	21-040-CM
pipetman	any		For sterile cell culture
pipette tips	any		For sterile cell culture
Precision GP 10 liquid incubator	Thermo Scientific	TSGP02
T25 flask	Corning	430639
T75 flask	Corning	430641U
SHEAR ASSAY
100 mL beaker	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
DMEM	Corning
Flow chamber + rubber gasket	Glycotech	31-001	Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes)
Hybrid Rheometer	HR-2 Discovery Hybrid Rheometer		For determination of shear fluid viscosity
magnetic stir bar	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
magnetic stir plate	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
methyl cellulose	any		To increase viscosity of DMEM in flow media
Syringe Pump	KD Scientific Geminin 88 plus	788088	For programming fluid infusion and withdrawal
syringes, tubing, and connectors			For shear apparatus setup
SOFTWARE
ABAQUS software	Simulia
Digitial Image Correlation software	LaVision, Germany	DAVIS 10.1.2
Imaging software	Leica/any microscope software
MATLAB	MATLAB	MATLAB_R2020B