単一セル材料特性を決定するためのせん断アッセイプロトコル

要約

このプロトコルは、 in vitroでの癌性および非癌性細胞株の機械的特性の定量化の概要を示しています。がん細胞と正常細胞の機構における保存された違いは、予後と診断に影響を与える可能性のあるバイオマーカーとして機能する可能性があります。

要約

不規則なバイオメカニクスは、広範な研究の対象となる癌生物学の特徴です。セルの機械的特性は、材料の機械的特性と似ています。ストレスやひずみに対する細胞の耐性、緩和時間、弾力性はすべて、他のタイプの細胞と比較することができる特性です。癌性(悪性)細胞と正常(非悪性)細胞の機械的特性を定量化することで、研究者はこの病気の生物物理学的基礎をさらに明らかにすることができます。がん細胞の機械的性質は、正常細胞の機械的性質とは一貫して異なることが知られているが、培養中の細胞からこれらの性質を推定する標準的な実験手順は不足している。

この論文では、流体せん断アッセイを使用して in vitro で単一細胞の機械的特性を定量化する手順の概要を説明します。このアッセイの背後にある原理は、単一の細胞に流体せん断応力を適用し、結果として生じる細胞の変形を経時的に光学的に監視することです。その後、デジタル画像相関(DIC)解析を使用して細胞の機械的特性を特徴付け、DIC解析から生成された実験データに適切な粘弾性モデルをフィッティングします。全体として、ここで概説するプロトコルは、治療が困難な癌の診断のためのより効果的で標的を絞った方法を提供することを目的としています。

概要

がん細胞と非がん細胞の生物物理学的な違いを研究することで、新しい診断および治療の機会が可能になります¹。バイオメカニクス/メカノバイオロジーの違いが腫瘍の進行と治療抵抗性にどのように寄与するかを理解することで、標的療法と早期診断の新しい道が明らかになります²。

がん細胞の機械的性質(原形質膜や核膜の粘弾性^など)は正常細胞と異なることが知られていますが3,4,5、^生細胞でこれらの性質を測定するための堅牢で再現性のある方法は不足しています⁶。せん断アッセイ法は、単一細胞を流体せん断応力にさらし、加えられた応力に対する個々の応答および抵抗を分析することにより、細胞の機械的特性を定量化するために使用されます3,4,5,7,8,9。

プロトコル

1. シングルセルせん断アッセイの調製

1. 細胞培養
   1. 約50,000個の懸濁単細胞を、2 mLの培地を含む35 mm x 10 mmのシャーレに播種します。
      注:播種前に懸濁細胞を渦流して、細胞凝集塊を分解します。
   2. 細胞を37°Cでインキュベートし、細胞付着と完全な細胞骨格タンパク質形成のために10〜48時間待ちます。
      注:細胞凝集を回避しながら適切な細胞増殖と付着を確保するために、細胞付着の期間、ならびに増殖および増殖速度を考慮してください。これらのパラメータは細胞の種類によって異なります。

2. せん断アッセイ実験

1. せん断アッセイ粘性流動媒体の調製
   1. わずかに粘性のある流動媒体(0.015-0.02 Pa·s)を確保するには、0.05 wt%の非毒性および非アレルギー性メチルセルロース(4 Pa·s)を測定し、培地に加えます。
   2. 均一な混合を確保するには、マグネチックスターラー/ホットプレートを使用して、ベース培養培地を~60-70°Cの温度で~10-20分間予熱します。メディアを連続的に攪拌しながら、メチルセルロース粒子の凝固を避けるために、メチルセルロースが迅速に分散するように穏やかに添加する。このプロセスを~15-24時間継続して、培地+セルロースの....

結果

DICと粘弾性モデルを使用した変形解析と組み合わせたせん断アッセイプロトコルは、in vitroで単一細胞の機械的特性を定量化することに成功しています。この方法は、正常ヒト乳細胞(MCF-10A)^3,4,9、低転移性トリプルネガティブ乳がん細胞(MDA-MB-468)3、トリプルネガティブ乳がん細胞(MDA-MB-231)³、ヒト?.......

ディスカッション

せん断アッセイ法は、細胞と周囲の機械的微小環境との相互作用および機械的ストレスに対するそれらの応答をシミュレートするための疑似機械生物学的環境の設定を含み、そのパターンが癌性細胞株間の保存された物理的異型を示す細胞機械的特性のカタログを作成しました3,4,5,7,8

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL CULTURE
.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate	Corning	25-053-ci	For cellular detachment from substrate in cell culture
15 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	05-527-90
35 mm Petri dishes	Corning	430165
50 mL centrifuge tubes	Falcon by Corning	14-432-22
centrifuge	any		For sterile cell culture
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x	Corning	10-013-cv	Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells
gloves	any		For sterile cell culture
Heracell Vios 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51033770	For Incubation during cell culture
Hood	any		For sterile cell culture
micropipette	any		For sterile cell culture
micropipette tips	any		For sterile cell culture
Microscope	Leica/any		For sterile cell culture
Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x	Corning	21-040-CM
pipetman	any		For sterile cell culture
pipette tips	any		For sterile cell culture
Precision GP 10 liquid incubator	Thermo Scientific	TSGP02
T25 flask	Corning	430639
T75 flask	Corning	430641U
SHEAR ASSAY
100 mL beaker	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
DMEM	Corning
Flow chamber + rubber gasket	Glycotech	31-001	Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes)
Hybrid Rheometer	HR-2 Discovery Hybrid Rheometer		For determination of shear fluid viscosity
magnetic stir bar	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
magnetic stir plate	any		For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media
methyl cellulose	any		To increase viscosity of DMEM in flow media
Syringe Pump	KD Scientific Geminin 88 plus	788088	For programming fluid infusion and withdrawal
syringes, tubing, and connectors			For shear apparatus setup
SOFTWARE
ABAQUS software	Simulia
Digitial Image Correlation software	LaVision, Germany	DAVIS 10.1.2
Imaging software	Leica/any microscope software
MATLAB	MATLAB	MATLAB_R2020B