احتباس جزيئي عالمي مع مجهر تمدد 11 ضعفا

Summary

يظهر هنا إصدار جديد من الفحص المجهري التوسعي (ExM) ، Magnify ، والذي تم تعديله لتوسع يصل إلى 11 ضعفا ، مع الحفاظ على مجموعة شاملة من فئات الجزيئات الحيوية ، وهو متوافق مع مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة. إنه يتيح استجواب التكوين النانوي للجزيئات الحيوية باستخدام المجاهر التقليدية المحدودة الحيود.

Abstract

يمكن للتصوير النانوي للعينات البيولوجية تحسين فهم التسبب في المرض. في السنوات الأخيرة ، ثبت أن الفحص المجهري التوسعي (ExM) بديل فعال ومنخفض التكلفة للفحص المجهري البصري فائق الدقة. ومع ذلك ، فقد تم تقييده بسبب الحاجة إلى عوامل تثبيت محددة وغالبا ما تكون مخصصة للاحتفاظ بفئات مختلفة من الجزيئات الحيوية داخل الجل وبسبب الصعوبات في توسيع تنسيقات العينات السريرية القياسية ، مثل الأنسجة المضمنة في البارافين المثبتة بالفورمالين ، خاصة إذا كانت عوامل التمدد الأكبر أو حوامل البروتين المحفوظة مطلوبة. هنا ، نصف Magnify ، وهي طريقة ExM جديدة للتوسع القوي حتى 11 ضعفا في مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة. باستخدام الميثاكرولين كمرساة كيميائية بين الأنسجة والهلام ، يحتفظ Magnify بجزيئات حيوية متعددة ، مثل البروتينات والدهون والأحماض النووية ، داخل الهلام ، مما يسمح بالتصوير النانوي الواسع للأنسجة على المجاهر الضوئية التقليدية. يصف هذا البروتوكول أفضل الممارسات لضمان تمدد الأنسجة القوي والخالي من التشققات ، بالإضافة إلى نصائح للتعامل مع المواد الهلامية الموسعة للغاية وتصويرها.

Introduction

تظهر الأنظمة البيولوجية عدم تجانس هيكلي ، من الأطراف والأعضاء وصولا إلى مستويات البروتينات على المستوى النانوي. لذلك ، يتطلب الفهم الكامل لتشغيل هذه الأنظمة فحصا بصريا عبر مقاييس الحجم هذه. ومع ذلك ، فإن حد حيود الضوء يسبب تحديات في تصور الهياكل الأصغر من ~ 200-300 نانومتر على مجهر مضان تقليدي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الطرق البصرية فائقة الدقة¹،²،³ ، مثل استنفاد الانبعاثات المحفزة (STED) ، والمجهر التعريبي المنشط بالصور (PALM) ، ومجهر إعادة البناء البصري العشوائي (STORM) ، والمجهر الضوئي للإضاءة الهيكلية (SIM) ^، على الرغم من قوتها ، تمثل تحدياتها الخاصة ^، لأنها تتطلب أجهزة وكو....

Protocol

تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية التي تنطوي على الحيوانات وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة (NIH) وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في جامعة كارنيجي ميلون. تم الحصول على عينات الأنسجة البشرية تجاريا.

1. إعداد كواشف المخزون والمحاليل

ملاحظة: ارجع إلى جدول المواد للحصول على قائمة بالكواشف المستخدمة.

1. تحضير حلول مخزون التبلور. سيتم الجمع بين هذه مباشرة قبل خطوة التبلور.
   1. تحضير محلول مخزون المونومر (4 جم / 100 مل N ، N- حمض ثنائي ميثيل أكريلاميد [DMAA] ، 50 جم / 100 مل أكريلات الصوديوم [SA] ، 66.7 جم / 100 مل أكريلاميد [AA] ، 0.10 ....

النتائج

إذا تم إكمال البروتوكول بنجاح (الشكل 1) ، فستظهر العينة واضحة ومسطحة بعد تمسخ الحرارة ؛ أي طي أو تجعد يشير إلى تجانس غير كامل. ستكون العينة الموسعة بنجاح أكبر بمقدار 3-4.5 مرة مما كانت عليه قبل التمدد في 1x PBS وأكبر من 8-11 ضعفا عند توسيعها بالكامل في ddH₂O. يوضح الشك?.......

Discussion

هنا ، نقدم بروتوكول Magnify 17 ، وهو متغير ExM يمكنه الاحتفاظ بجزيئات حيوية متعددة مع مرساة كيميائية واحدة وتوسيع العينات السريرية FFPE الصعبة حتى¹¹ ضعفا مع تمسخ الحرارة. تشمل التغييرات الرئيسية في هذا البروتوكول التي تميزه عن بروتوكولات ExM الأخرى استخدام هلام معاد صياغته يظل قويا مي?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)	Cellvis	P06-1.5H-N
Acrylamide	Sigma Aldrich	A8887	Gel Monomer component
Ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiatior
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10)	Sigma Aldrich	P9769	Non-ionic surfactant
Diamond knife No. 88 CM	General Tools	31116
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M	VWR	BDH7830-1	Homogenization Buffer Component
Forceps
Glycine	Sigma Aldrich	G8898	Homogenization Buffer Component
Heparin	Sigma Aldrich	H3393
Methacrolein	Sigma Aldrich	133035	Anchoring Agent
Micro cover Glass #1 (24x60mm)	VWR	48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis)	Sigma Aldrich	M7279	Gel Monomer component
N,N-dimethylacrylamide (DMAA)	Sigma Aldrich	274135	Gel Monomer component
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish	Thermo Fisher	167063
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish	Thermo Fisher	140675
Nunc™ 15mL Conical	Thermo Fisher	339651
Nunc™ 50mL Conical	Thermo Fisher	339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution	Fischer Scientific	BP399-1
Polyethylene glycol  200	Sigma Aldrich	P-3015
Proteinase K (Molecular Biology Grade)	Thermo Scientific	EO0491
Razor blade	Fischer Scientifc	12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
Sodium acrylate (SA)	AK Scientific	R624	Gel Monomer component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L3771	Homogenization Buffer Component
Tris Base	Fischer Scientific	BP152-1	Homogenization Buffer Component
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Urea	Sigma Aldrich	U5378	Homogenization Buffer Component
Xylenes	Sigma Aldrich	214736
20x SSC	Thermo Scientific	AM9763
Tween20	Sigma Aldrich	P1379
poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P8920