احتباس جزيئي عالمي مع مجهر تمدد 11 ضعفا

Summary

يظهر هنا إصدار جديد من الفحص المجهري التوسعي (ExM) ، Magnify ، والذي تم تعديله لتوسع يصل إلى 11 ضعفا ، مع الحفاظ على مجموعة شاملة من فئات الجزيئات الحيوية ، وهو متوافق مع مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة. إنه يتيح استجواب التكوين النانوي للجزيئات الحيوية باستخدام المجاهر التقليدية المحدودة الحيود.

Abstract

يمكن للتصوير النانوي للعينات البيولوجية تحسين فهم التسبب في المرض. في السنوات الأخيرة ، ثبت أن الفحص المجهري التوسعي (ExM) بديل فعال ومنخفض التكلفة للفحص المجهري البصري فائق الدقة. ومع ذلك ، فقد تم تقييده بسبب الحاجة إلى عوامل تثبيت محددة وغالبا ما تكون مخصصة للاحتفاظ بفئات مختلفة من الجزيئات الحيوية داخل الجل وبسبب الصعوبات في توسيع تنسيقات العينات السريرية القياسية ، مثل الأنسجة المضمنة في البارافين المثبتة بالفورمالين ، خاصة إذا كانت عوامل التمدد الأكبر أو حوامل البروتين المحفوظة مطلوبة. هنا ، نصف Magnify ، وهي طريقة ExM جديدة للتوسع القوي حتى 11 ضعفا في مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة. باستخدام الميثاكرولين كمرساة كيميائية بين الأنسجة والهلام ، يحتفظ Magnify بجزيئات حيوية متعددة ، مثل البروتينات والدهون والأحماض النووية ، داخل الهلام ، مما يسمح بالتصوير النانوي الواسع للأنسجة على المجاهر الضوئية التقليدية. يصف هذا البروتوكول أفضل الممارسات لضمان تمدد الأنسجة القوي والخالي من التشققات ، بالإضافة إلى نصائح للتعامل مع المواد الهلامية الموسعة للغاية وتصويرها.

Introduction

تظهر الأنظمة البيولوجية عدم تجانس هيكلي ، من الأطراف والأعضاء وصولا إلى مستويات البروتينات على المستوى النانوي. لذلك ، يتطلب الفهم الكامل لتشغيل هذه الأنظمة فحصا بصريا عبر مقاييس الحجم هذه. ومع ذلك ، فإن حد حيود الضوء يسبب تحديات في تصور الهياكل الأصغر من ~ 200-300 نانومتر على مجهر مضان تقليدي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الطرق البصرية فائقة الدقة¹،²،³ ، مثل استنفاد الانبعاثات المحفزة (STED) ، والمجهر التعريبي المنشط بالصور (PALM) ، ومجهر إعادة البناء البصري العشوائي (STORM) ، والمجهر الضوئي للإضاءة الهيكلية (SIM) ^، على الرغم من قوتها ، تمثل تحدياتها الخاصة ^، لأنها تتطلب أجهزة وكواشف باهظة الثمن وغالبا ما يكون لها أوقات اكتساب بطيئة وقدرة ضعيفة على تصوير كميات كبيرة في 3D.

يوفر الفحص المجهري التوسعي⁴ (ExM) وسيلة بديلة للتحايل على حد حيود الضوء عن طريق تثبيت الجزيئات الحيوية تساهميا في هلام بوليمر قابل للانتفاخ بالماء وسحبها جسديا ، مما يجعلها قابلة للحل على المجاهر الضوئية التقليدية. تم تطوير العديد من متغيرات بروتوكول ExM منذ النشر الأصلي ل ExM قبل أقل من عقد من الزمان ، وتسمح هذه البروتوكولات بالدمج المباشر للبروتينات⁵،⁶،⁷ أو RNA⁸،^9،10 أو الدهون¹¹،^12،13 في شبكة الهلام عن طريق تغيير المرساة الكيميائية أو توسيع العينة بشكل أكبر (وبالتالي تحسين الدقة الفعالة) إما في خطوة واحدة¹⁴ أو خطوات تكرارية متعددة^15,16. حتى وقت قريب ، لا يمكن لأي بروتوكول ExM واحد الاحتفاظ بهذه الفئات الثلاث من الجزيئات الحيوية مع مرساة كيميائية واحدة متاحة تجاريا مع توفير هلام قوي ميكانيكيا يمكن أن يتوسع ~ 10 أضعاف في جولة توسع واحدة.

هنا ، نقدم Magnify¹⁷ ، وهي إضافة حديثة إلى ترسانة ExM التي تستخدم الميثاكرولين كمرساة للجزيء الحيوي. يشكل الميثاكرولين روابط تساهمية مع أنسجة مثل تلك الموجودة في بارافورمالدهيد ، مما يضمن إمكانية الاحتفاظ بفئات متعددة من الجزيئات الحيوية داخل شبكة الهلام دون الحاجة إلى عوامل تثبيت محددة أو مخصصة مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذه التقنية توسيع نطاق واسع من الأنسجة حتى 11 ضعفا ، بما في ذلك العينات الصعبة المعروفة مثل العينات السريرية المضمنة بالبارافين المثبتة بالفورمالين (FFPE). تطلبت الطرق السابقة لتوسيع مثل هذه العينات الصلبة ميكانيكيا هضم البروتياز القاسي ، مما يجعل وضع علامات على الأجسام المضادة للبروتينات ذات الأهمية مستحيلا بعد توسيع العينة. في المقابل ، تحقق هذه التقنية توسيع العينات السريرية FFPE باستخدام محلول تغيير الطبيعة الساخن ، وبالتالي الحفاظ على حوائط البروتين الكاملة داخل الجل ، والتي يمكن استهدافها للتصوير بعد التمدد (الشكل 1).

Protocol

تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية التي تنطوي على الحيوانات وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة (NIH) وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في جامعة كارنيجي ميلون. تم الحصول على عينات الأنسجة البشرية تجاريا.

1. إعداد كواشف المخزون والمحاليل

ملاحظة: ارجع إلى جدول المواد للحصول على قائمة بالكواشف المستخدمة.

1. تحضير حلول مخزون التبلور. سيتم الجمع بين هذه مباشرة قبل خطوة التبلور.
   1. تحضير محلول مخزون المونومر (4 جم / 100 مل N ، N- حمض ثنائي ميثيل أكريلاميد [DMAA] ، 50 جم / 100 مل أكريلات الصوديوم [SA] ، 66.7 جم / 100 مل أكريلاميد [AA] ، 0.10 جم / 100 مل N ، N′-ميثيلين بيساكريلاميد [مكرر] ، 33 جم / 100 مل كلوريد الصوديوم [NaCl] ، 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ PBS) باستخدام المكونات المدرجة في الجدول 1. حل أو تمييع جميع حلول الأسهم في الماء. يمكن تخزين محلول مخزون المونومر عند 4 درجات مئوية لمدة 3 أشهر على الأقل.
   2. اصنع محاليل المخزون التالية بشكل منفصل في الماء: 0.5٪ (وزن / وزن) 4-هيدروكسي-تيمبو (4HT) ، الذي يمنع الهلام أثناء انتشار المونومر في الأنسجة ، و 10٪ (وزن / وزن) رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) ، مما يسرع الجيل الجذري الذي بدأه بيرسلفات الأمونيوم (APS) ويتم تحضيره بنسبة 10٪ (وزن / وزن).
      ملاحظة: يمكن توزيع محاليل المخزون في 1-2 مل من القسامات وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر ؛ ومع ذلك، APS يتم مباشرة قبل تحضير محلول التبلور.
2. قم بإعداد المخزن المؤقت للتجانس (1٪ وزن / وزن SDS ، 8 ميجا يوريا ، 25 مللي متر EDTA ، 2x PBS ، درجة الحموضة 8 ، في درجة حرارة الغرفة [RT]) عن طريق الجمع بين 1 جم من SDS ، 48.048 جم من اليوريا ، 5 مل من EDTA (0.5 م ، درجة الحموضة 8) ، 20 مل من 10x PBS ، 25 مل من Tris (2 M) ، و 0.75 جم من الجلايسين. أضف الماء لحجم كلي قدره 100 مل. يمكن توسيع نطاق الحل أو تقليله حسب الحاجة ويمكن تخزينه في R.T.

2. تحضير الأنسجة لشرائح الأنسجة السريرية المؤرشفة والمحضرة حديثا

ملاحظة: تختلف خطوات المعالجة المسبقة للأنسجة بناء على كيفية تحضير العينات.

1. بالنسبة للعينات السريرية المضمنة بالبارافين المثبت بالفورمالديهايد (FFPE) ، اتبع الخطوات أدناه.
   1. ضع العينات في سلسلة متسلسلة من المحاليل (يمكن استخدام جرة تلطيخ منزلقة زجاجية أو أنبوب مخروطي سعة 50 مل): زيلين ، 95٪ إيثانول ، 70٪ إيثانول ، و 50٪ إيثانول ، متبوعا بماء مضاعف منزوع الأيونات. استخدم كل محلول مرتين لمدة 3 دقائق على الأقل في كل مرة. استخدم ملقط لوضع الشريحة في الحاوية ، وأضف 15 مل من المحلول المعني (يكفي لتغطية العينة). ضع الأنبوب المخروطي المغطى أفقيا على شاكر في درجة حرارة الغرفة.
2. بالنسبة للعينات الملطخة والمثبتة على شرائح دائمة ، اتبع الخطوات أدناه.
   1. ضع الشريحة لفترة وجيزة في الزيلين ، وقم بإزالة أغطية الغطاء بعناية باستخدام أداة مناسبة ، مثل شفرة الحلاقة. إذا ظل غطاء الغطاء عالقا ، فأعد الشرائح الموجودة في الزيلين إلى درجة حرارة الغرفة حتى ترتخي شريحة الغطاء.
   2. بعد ذلك، قم بمعالجة العينات كعينات FFPE (الخطوة 2.1.1).
      ملاحظة: بالنسبة للشرائح الملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) ، يتم فقد صبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين أثناء عملية التمدد.
3. بالنسبة لشرائح الأنسجة المجمدة غير الثابتة في محلول درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ، ثبت الأنسجة في الأسيتون عند -20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل غسل العينات بمحلول 1x PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة في درجة حرارة الغرفة.
4. بالنسبة لشرائح الأنسجة السريرية المجمدة التي تم إصلاحها مسبقا ، قم بإذابة OCT عن طريق احتضان الشرائح لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسلها بمحلول 1x PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة في درجة حرارة الغرفة.

3. تحضير الأنسجة لدماغ الفأر الثابت بارافورمالدهايد

1. اتبع هذا البروتوكول لأقسام دماغ الفأر التي يبلغ سمكها 30-50 ميكرومتر.
   ملاحظة: يمكن العثور على النجاح مع أقسام أكبر ، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى أوقات أطول لنشر محلول المونومر والتجانس.
2. إذا لم يتم تخزين الأقسام حاليا في محلول 1x PBS (على سبيل المثال ، في 30٪ [v / v] جلسرين و 30٪ [v / v] محلول جلايكول الإيثيلين في 1x PBS) ، اغسل ثلاث مرات لمدة 10 دقائق على الأقل في كل مرة في درجة حرارة الغرفة في 1x PBS في لوحة من 6 إلى 24 بئرا.
3. احصل على شريحة مجهرية زجاجية غير مطلية. إذا كان جانب واحد من الشريحة الزجاجية مطليا ، فاستخدم فرشاة طلاء مبللة للتحقق من الجانب غير المطلي (غالبا ما يكون ملصق الجانب المطلي مصنوعا من الزجاج الأرضي وسيصبح أقل عتامة عند البلل).
4. استخدم فرشاة الرسم لتبليل الشريحة غير المطلية. قم بإزالة أنسجة دماغ الفأر من لوحة البئر باستخدام فرشاة الرسم ، وضعها بعناية على الشريحة ، باستخدام حركة متدحرجة للتأكد من أن الأنسجة مسطحة. اسمح ل PBS الزائد بالبقاء على الأنسجة حتى يتم تركيب جميع الأقسام.
   ملاحظة: بينما يمكن استخدام شريحة زجاجية واحدة لأقسام الأنسجة المتعددة ، عندما يتم تبلور المزيد من أقسام الأنسجة في وقت واحد (حتى على شرائح منفصلة) ، يجب توخي المزيد من الحذر لضمان عدم جفافها تماما.
5. باستخدام قطعة قماش ورقية معملية ، قم بإزالة غالبية PBS الزائدة من الشريحة. اترك حلقة سائلة صغيرة حول كل قسم من الأنسجة ، لكن اترك بقية الشريحة جافة في الغالب. سيغطي هذا السائل المتبقي الأنسجة أثناء تحضير محلول مونومر الهلام.

4. التبلور

ملاحظة: هذا البروتوكول مناسب لجميع أنواع الأنسجة المعدة للاستخدام مع هذه التقنية.

1. ضع فواصل على جانبي قسم الأنسجة (الشكل 2 أ) لمنع ضغط الأنسجة. للقيام بذلك ، اصنع الفواصل عن طريق قطع رقيقة من زجاج الغطاء باستخدام قلم ذو رأس ماسي ، ثم قم بتثبيتها على الشريحة باستخدام كميات صغيرة من الماء أو 1x PBS ، أو قم بتثبيتها باستخدام كمية صغيرة من الغراء الفائق. بعد ذلك ، ضع الفواصل برفق على جانبي المنديل.
2. تحضير حل التبلور النهائي. بشكل عام ، ~ 200 ميكرولتر كافية لكل قسم من الأنسجة ، ولكن يجب ألا يتجاوز الحجم 800 ميكرولتر لكل شريحة. أي محلول تبلور آخر سيؤدي إلى امتداد.
   ملاحظة: يستخدم الميثاكرولين لتثبيت الجزيئات الحيوية في الجل. ومع ذلك ، لا يلزم وجود خطوة تثبيت منفصلة ، ويمكن إضافة الميثاكرولين مباشرة إلى محلول التبلور النهائي.
   1. لكل قسم ، اجمع ما يلي بالترتيب: 200 ميكرولتر من محلول المونومر ، 0.5 ميكرولتر من محلول مخزون 4HT 0.5٪ (1: 400 تخفيف) ، 0.2-0.5 ميكرولتر من الميثاكرولين (1: 400-1: 1000 تخفيف حسب نوع الأنسجة ؛ بشكل عام ، استخدم تخفيف 1: 1000 للعينات الثابتة بارافورمالدهايد [PFA] و 1: 400 للعينات السريرية FFPE) ، 2 ميكرولتر من محلول مخزون TEMED بنسبة 10٪ (تخفيف 1: 100) ، و 5 ميكرولتر من محلول مخزون APS بنسبة 10٪ (تخفيف 1:40).
      ملاحظة: تحضير محلول التبلور النهائي مباشرة قبل الاستخدام. لمنع التبلور المبكر ، أضف APS الحل أخيرا.
3. قم بإزالة المحلول الزائد من قسم الأنسجة ، وضع الشريحة في طبق بتري. أضف كل محلول التبلور البارد المحضر حديثا إلى العينة، واحتضن الخليط على المنديل لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية للسماح بالانتشار في الأنسجة.
4. ضع شريحة زجاجية ثانية غير مطلية بعناية فوق محلول الأنسجة والهلام. يجب تجنب فقاعات الهواء (الشكل 2 ب).
   ملاحظة: إذا أصبحت فقاعات الهواء محاصرة فوق المنديل ، فقد يتم رفع الغطاء الزجاجي بعناية ووضعه مرة أخرى. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتم قطع أي محلول مونومر ينسكب بعد البلمرة ولن يسبب أي مشاكل للأنسجة.
5. تأكد من اكتمال البلمرة. يمكن إجراء هذه البلمرة بطريقتين ، ينتج عن كل منهما نتائج مماثلة. أولا ، احتضان العينات عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة (مثل طبق بتري مغلق بمنشفة ورقية مبللة) طوال الليل. بدلا من ذلك ، لمزيد من البلمرة السريعة ، احتضان العينات في الغلاف الجوي المرطب لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية تليها 1 ساعة عند 60 درجة مئوية.

5. عينة الهضم وتوسيع الأنسجة

ملاحظة: هذا البروتوكول مناسب لجميع أنواع الأنسجة.

1. عند ارتداء واقي العين ، حرك شفرة حلاقة بين الشريحتين الزجاجيتين لغرفة التبلور لفصلهما.
   ملاحظة: يجب فصل الشرائح الزجاجية بسهولة بالغة. إذا كانت أجزاء مختلفة من الجل عالقة في كلتا الشريحتين ، فيمكن استخدام فرشاة رسم لتوجيه الجل إلى أحدهما أو الآخر. إذا أصبح الجل جافا بشكل خاص أثناء البلمرة ، فيمكن تطبيق 1x PBS على الجزء الخارجي من حجرة الهلام ، ولكن لا تغمر الجل بالكامل ، لأن هذا سيؤدي إلى تمدده قبل تجانس الأنسجة ، مما يؤدي إلى التشقق.
2. قم بقص الجل الفارغ حول المنديل لتقليل الحجم. يسمح قطع الجل بشكل غير متماثل بتتبع اتجاه الجل بعد التجانس ، حيث ستكون العينة شفافة تماما.
3. ارفع الجل المحتوي على الأنسجة برفق من الشريحة بشفرة حلاقة ، وانقله برفق إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل باستخدام فرشاة رسم.
4. املأ الأنبوب إلى الأعلى بمخزن مؤقت للتجانس (الجدول 2) مسخن مسبقا إلى 80 درجة مئوية.
5. احتضان العينة مع الاهتزاز عند 80 درجة مئوية لمدة 8 ساعات (لدماغ الفأر الثابت PFA) أو 60 ساعة (معظم العينات السريرية FFPE ؛ انظر الجدول 3).
   ملاحظة: يعتمد وقت التجانس على نوع الأنسجة وطريقة التثبيت. تم التحقق من صحة العديد من هذه الشروط بالفعل ، ولكن بالنسبة للآخرين ، قد يكون التحسين ضروريا.
6. صب محتويات أنبوب الطرد المركزي في بئر واحد من لوحة زراعة الخلايا البلاستيكية ذات 6 آبار.
7. قم بإزالة المخزن المؤقت للتمسخ باستخدام ماصة نقل.
8. لإزالة SDS المتبقية تماما من الهيدروجيل ، اغسل العينة في محلول خافض للتوتر السطحي غير أيوني بنسبة 1٪ (C₁₂E 10) على النحو التالي: ثلاث مرات على الأقل لمدة₁₀ دقائق في كل مرة في درجة حرارة الغرفة ؛ لمدة 60 دقيقة عند 60 درجة مئوية ؛ ثم ثلاث غسلات أخرى لمدة 10 دقائق في كل مرة في درجة حرارة الغرفة.
9. قم بتخزين العينة في 1x PBS + 0.02٪ أزيد الصوديوم عند 4 درجات مئوية حتى يلزم إجراء التلوين والتصوير بعد التوسع.
   ملاحظة: في هذه المرحلة ، يجب أن تكون العينة أكبر ~ 3-4.5 أضعاف في كل بعد ، اعتمادا على نوع الأنسجة.

6. التنميط الجزيئي الحيوي بعد التوسع

1. تلطيخ الأجسام المضادة
   ملاحظة: يتبع هذا بروتوكول تلطيخ نموذجي للتألق المناعي (IF) / الكيمياء الهيستولوجية المناعية (I.H.C). تعتمد كميات الأجسام المضادة الأولية والثانوية المستخدمة على التركيزات المقترحة من قبل الشركة المصنعة أو عن طريق التحسين للتجربة المحددة. يمكن استبدال المخازن المؤقتة الفردية وفقا لتقدير المستخدم.
   1. مع العينة في بئر واحد من لوحة زراعة الخلايا ذات 6 آبار ، اغسل العينات الموسعة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة في 1x PBS في RT ، مع نقل السائل باستخدام ماصة.
   2. قم بإجراء خطوة حظر اختيارية (على سبيل المثال ، 3٪ ألبومين مصل بقري / 0.1٪ Triton-X100 في 1x PBS) لمدة ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   3. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في العازلة تلطيخ (على سبيل المثال، 0.1٪ Triton-X100 1x PBS أو 9x PBS / 1٪ TritonX / 10 ملغ / لتر الهيبارين) طوال الليل عند 37 درجة مئوية. اعتمادا على حجم العينة ، يجب أن يغطي 0.5-2 مل الجل بشكل كاف.
   4. اغسل العينة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق على الأقل في كل مرة في 1x PBS في درجة حرارة الغرفة.
   5. احتضان في الأجسام المضادة الثانوية المقابلة لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية في المخزن المؤقت للتلطيخ المفضل.
   6. اغسل العينة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق على الأقل في كل مرة في 1x PBS في درجة حرارة الغرفة.
2. NHS-استر عموم تلطيخ البروتين
   1. مع العينة في لوحة من 6 آبار ، صب 1-2 مل من البولي إيثيلين جلايكول (PEG 200) على العينة (يكفي لتغطيتها بالكامل).
      ملاحظة: يجب أن يتقلص النسيج ويعود إلى حجمه الأصلي قبل التمدد (أو بالقرب منه).
   2. بقعة مع الفلوروفور مترافق NHS-استر مخفف إلى 13.3-80 ميكروغرام / مل لمدة 3 ساعات في R.T. في 1-2 مل من المخزن المؤقت للتلطيخ (على سبيل المثال ، 1x PBS ، 2x SSC ، أو 100 mM محلول بيكربونات الصوديوم).
   3. اغسل العينة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق على الأقل في كل مرة في 1x PBS في درجة حرارة الغرفة.
3. تلطيخ الدهون
   ملاحظة: تلطيخ الدهون بعد التمدد غير فعال على العينات السريرية FFPE ، حيث يتم فقدان الدهون أثناء عملية التثبيت.
   1. اغسل العينة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق على الأقل في كل مرة في 1x PBS في درجة حرارة الغرفة.
   2. ضع صبغة تقليدية محبة للدهون (DiO أو DiI أو DiD) مخففة 200 ضعف في 2 مل من 0.1٪ TritonX-100 / 1x PBS لمدة 72-96 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   3. اغسل ثلاث مرات على الأقل باستخدام 1x PBS
4. التهجين الفلوري في الموقع (FISH)
   1. ضع عينات الجل المتجانسة في مخزن مؤقت للتهجين مسخن مسبقا إلى 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   2. تحضير المخزن المؤقت للتهجين ل FISH: الجمع بين 2x S.S.C. (300 mM كلوريد الصوديوم ، 30 mM سترات الصوديوم ، درجة الحموضة 7.0) ، 10٪ (v / v) كبريتات ديكستران ، 20٪ (v / v) كربونات الإيثيلين ، و 0.1٪ (v / v) Tween20.
   3. احتضان عينات الهلام بمخزن مؤقت تهجين يحتوي على 10 pM (لكل oligo) من مجسات FISH ضد الجين المستهدف (20 مجسا على الأقل لكل 10 كيلو بايت) عند 45 درجة مئوية طوال الليل.
   4. اغسل بمحلول غسيل صارم (2x S.S.C. و 0.1٪ Tween20) مرتين لمدة 15 دقيقة في كل مرة عند 45 درجة مئوية.
   5. يغسل بعازل غسيل صارم مرتين أخريين لمدة 10 دقائق في كل مرة عند 37 درجة مئوية.
   6. أخيرا ، اغسل باستخدام 1x PBS ثلاث مرات على الأقل لمدة 10 دقائق في كل مرة في درجة حرارة الغرفة.
   7. العينات جاهزة للتصوير أو التخزين في 1x PBS + 0.02٪ أزيد الصوديوم عند 4 درجات مئوية.
5. تمدد الأنسجة بالكامل والتصوير الفلوري
   ملاحظة: يختلف عامل التمدد الذي يمكن تحقيقه باستخدام التكبير باختلاف نوع الأنسجة وطريقة التمدد (يمكن العثور على ملخص كامل في الجدول 3). ومع ذلك ، كتقدير عام ، ستتوسع عينة Magnify 3-4.5 أضعاف في 1x PBS ، و 5-7 أضعاف في PBS مخففة إلى 1:50 في ddH 2 O، و 8-11 أضعاف في ddH₂O. يعتمد عامل التوسع الأمثل للتصوير على احتياجات كل تجربة. عامل التمدد قابل للضبط بدرجة كبيرة ، بحيث يمكن توسيع عينة واحدة وتقليصها عدة مرات للتصوير بمقاييس مختلفة.
   1. انقل العينات الموسعة 4 أضعاف في PBS إلى لوحة تصوير ذات 6 آبار ذات قاع زجاجي باستخدام فرشاة رسم. انقل أي عينة موسعة عن طريق تقطيعها إلى قطع أصغر أو وضعها برفق في لوحة تصوير كبيرة ذات قاع زجاجي بقطعة رقيقة من البلاستيك المرن.
   2. قم بإجراء التصوير الفلوري باستخدام مجهر تقليدي واسع المجال أو مجهر متحد البؤر أو نظام تصوير آخر من اختيارك. قد تؤدي إزالة السوائل الزائدة حول الجل بقطعة قماش مخبرية ورقية إلى منع حركة الهلام أثناء التصوير. يمكن أيضا تجميد المواد الهلامية عن طريق تطبيق 0.1٪ بولي-L-lysine على سطح الزجاج قبل التصوير.
      ملاحظة: تطبيق بولي-L-يسين سيجعل الجل غير متحرك تماما عند ملامسته. لهذا السبب ، يجب توخي الحذر من تطبيق الجل على الزجاج دون طي أو تمتد. بالإضافة إلى ذلك ، لا ينبغي السماح للهلام بالجفاف تماما على الزجاج المطلي ب poly-L-lysine ، لأن هذا قد يجعل الإزالة صعبة ، ويجب عدم تقليص الجل في PBS بينما لا يزال متصلا بالزجاج مع poly-L-lysine ، لأن هذا قد يتسبب في تلف الجل أو الأنسجة.
   3. بعد التصوير ، قم بتقليص العينات في 1x PBS مع ثلاث غسلات على الأقل لمدة 10 دقائق في كل مرة ، حيث لا ينصح بتخزين العينات على المدى الطويل في ddH₂O بسبب تدهور إشارة التألق. على وجه الخصوص ، يجب تصوير العينات الموسعة بالكامل الملطخة بالأصباغ المحبة للدهون في أقرب وقت ممكن من وقت التمدد لمنع تفكك الصبغة في الماء.
   4. قم بتخزين العينات في 1x PBS + 0.02٪ أزيد الصوديوم عند 4 درجات مئوية.

النتائج

إذا تم إكمال البروتوكول بنجاح (الشكل 1) ، فستظهر العينة واضحة ومسطحة بعد تمسخ الحرارة ؛ أي طي أو تجعد يشير إلى تجانس غير كامل. ستكون العينة الموسعة بنجاح أكبر بمقدار 3-4.5 مرة مما كانت عليه قبل التمدد في 1x PBS وأكبر من 8-11 ضعفا عند توسيعها بالكامل في ddH₂O. يوضح الشك?...

Discussion

هنا ، نقدم بروتوكول Magnify 17 ، وهو متغير ExM يمكنه الاحتفاظ بجزيئات حيوية متعددة مع مرساة كيميائية واحدة وتوسيع العينات السريرية FFPE الصعبة حتى¹¹ ضعفا مع تمسخ الحرارة. تشمل التغييرات الرئيسية في هذا البروتوكول التي تميزه عن بروتوكولات ExM الأخرى استخدام هلام معاد صياغته يظل قويا مي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)	Cellvis	P06-1.5H-N
Acrylamide	Sigma Aldrich	A8887	Gel Monomer component
Ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiatior
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10)	Sigma Aldrich	P9769	Non-ionic surfactant
Diamond knife No. 88 CM	General Tools	31116
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M	VWR	BDH7830-1	Homogenization Buffer Component
Forceps
Glycine	Sigma Aldrich	G8898	Homogenization Buffer Component
Heparin	Sigma Aldrich	H3393
Methacrolein	Sigma Aldrich	133035	Anchoring Agent
Micro cover Glass #1 (24x60mm)	VWR	48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis)	Sigma Aldrich	M7279	Gel Monomer component
N,N-dimethylacrylamide (DMAA)	Sigma Aldrich	274135	Gel Monomer component
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish	Thermo Fisher	167063
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish	Thermo Fisher	140675
Nunc™ 15mL Conical	Thermo Fisher	339651
Nunc™ 50mL Conical	Thermo Fisher	339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution	Fischer Scientific	BP399-1
Polyethylene glycol  200	Sigma Aldrich	P-3015
Proteinase K (Molecular Biology Grade)	Thermo Scientific	EO0491
Razor blade	Fischer Scientifc	12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
Sodium acrylate (SA)	AK Scientific	R624	Gel Monomer component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L3771	Homogenization Buffer Component
Tris Base	Fischer Scientific	BP152-1	Homogenization Buffer Component
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Urea	Sigma Aldrich	U5378	Homogenization Buffer Component
Xylenes	Sigma Aldrich	214736
20x SSC	Thermo Scientific	AM9763
Tween20	Sigma Aldrich	P1379
poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P8920