Универсальная молекулярная ретенция с 11-кратной расширительной микроскопией

Резюме

Здесь представлена новая версия расширительной микроскопии (ExM) Magnify, которая модифицирована для расширения до 11 раз, сохраняет широкий спектр классов биомолекул и совместима с широким спектром типов тканей. Он позволяет исследовать наноразмерную конфигурацию биомолекул с помощью обычных дифракционно-ограниченных микроскопов.

Аннотация

Наноразмерная визуализация биологических образцов может улучшить понимание патогенеза заболевания. В последние годы было продемонстрировано, что расширительная микроскопия (ExM) является эффективной и недорогой альтернативой оптической микроскопии сверхвысокого разрешения. Тем не менее, он был ограничен потребностью в специфических и часто индивидуальных якорных агентах для удержания различных классов биомолекул в геле, а также трудностями с расширением стандартных форматов клинических образцов, таких как фиксированная формалином парафинообразная ткань, особенно если требуются более крупные факторы расширения или сохраненные белковые эпитопы. В этой статье мы опишем Magnify, новый метод ExM для надежного расширения до 11 раз в широком спектре типов тканей. Используя метакролеин в качестве химического якоря между тканью и гелем, Magnify удерживает несколько биомолекул, таких как белки, липиды и нуклеиновые кислоты, внутри геля, что позволяет получать широкие наноразмерные изображения тканей на обычных оптических микроскопах. В этом протоколе описаны рекомендации по обеспечению прочного и свободного от трещин расширения тканей, а также советы по обращению и визуализации сильно расширенных гелей.

Введение

Биологические системы демонстрируют структурную гетерогенность, начиная от конечностей и органов и заканчивая уровнями белков на наноуровне. Таким образом, полное понимание работы этих систем требует визуального осмотра в этих размерных масштабах. Однако дифракционный предел света вызывает трудности при визуализации структур размером менее ~200-300 нм с помощью обычного флуоресцентного микроскопа. Кроме того, оптические методы^{сверхвысокого} разрешения 1,2,3, такие как истощение вынужденного излучения (STED), фотоактивируемая локализационная микроскопия (PALM), стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (STORM) и микроскопия структур....

протокол

Все экспериментальные процедуры с участием животных проводились в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения (NIH) и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Карнеги-Меллона. Образцы тканей человека были получены в промышленных масштабах.

1. Приготовление исходных реагентов и растворов

ПРИМЕЧАНИЕ: Список используемых реагентов см. в таблице материалов .

1. Приготовьте желирующие исходные растворы. Они будут объединены непосредственно перед этапом гелеобразования.
   1. Приготовьте исходный раствор мономера ....

Результаты

Если протокол был успешно завершен (рис. 1), образец будет выглядеть чистым и плоским после термической денатурации; Любая складка или сморщивание указывает на неполную гомогенизацию. Успешно расширенный образец будет в 3-4,5 раза больше, чем до расширения в 1x PBS, и в 8-11 раз ?.......

Обсуждение

Здесь мы представляем протокол Magnify 17, вариант ExM, который может удерживать несколько биомолекул с помощью одного химического якоря и расширять сложные клинические образцы FFPE до¹¹ раз с помощью тепловой денатурации. Ключевые изменения в этом протоколе, которые отличают его .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)	Cellvis	P06-1.5H-N
Acrylamide	Sigma Aldrich	A8887	Gel Monomer component
Ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiatior
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10)	Sigma Aldrich	P9769	Non-ionic surfactant
Diamond knife No. 88 CM	General Tools	31116
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M	VWR	BDH7830-1	Homogenization Buffer Component
Forceps
Glycine	Sigma Aldrich	G8898	Homogenization Buffer Component
Heparin	Sigma Aldrich	H3393
Methacrolein	Sigma Aldrich	133035	Anchoring Agent
Micro cover Glass #1 (24x60mm)	VWR	48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis)	Sigma Aldrich	M7279	Gel Monomer component
N,N-dimethylacrylamide (DMAA)	Sigma Aldrich	274135	Gel Monomer component
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish	Thermo Fisher	167063
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish	Thermo Fisher	140675
Nunc™ 15mL Conical	Thermo Fisher	339651
Nunc™ 50mL Conical	Thermo Fisher	339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution	Fischer Scientific	BP399-1
Polyethylene glycol  200	Sigma Aldrich	P-3015
Proteinase K (Molecular Biology Grade)	Thermo Scientific	EO0491
Razor blade	Fischer Scientifc	12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
Sodium acrylate (SA)	AK Scientific	R624	Gel Monomer component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L3771	Homogenization Buffer Component
Tris Base	Fischer Scientific	BP152-1	Homogenization Buffer Component
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Urea	Sigma Aldrich	U5378	Homogenization Buffer Component
Xylenes	Sigma Aldrich	214736
20x SSC	Thermo Scientific	AM9763
Tween20	Sigma Aldrich	P1379
poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P8920