Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Здесь представлена новая версия расширительной микроскопии (ExM) Magnify, которая модифицирована для расширения до 11 раз, сохраняет широкий спектр классов биомолекул и совместима с широким спектром типов тканей. Он позволяет исследовать наноразмерную конфигурацию биомолекул с помощью обычных дифракционно-ограниченных микроскопов.
Наноразмерная визуализация биологических образцов может улучшить понимание патогенеза заболевания. В последние годы было продемонстрировано, что расширительная микроскопия (ExM) является эффективной и недорогой альтернативой оптической микроскопии сверхвысокого разрешения. Тем не менее, он был ограничен потребностью в специфических и часто индивидуальных якорных агентах для удержания различных классов биомолекул в геле, а также трудностями с расширением стандартных форматов клинических образцов, таких как фиксированная формалином парафинообразная ткань, особенно если требуются более крупные факторы расширения или сохраненные белковые эпитопы. В этой статье мы опишем Magnify, новый метод ExM для надежного расширения до 11 раз в широком спектре типов тканей. Используя метакролеин в качестве химического якоря между тканью и гелем, Magnify удерживает несколько биомолекул, таких как белки, липиды и нуклеиновые кислоты, внутри геля, что позволяет получать широкие наноразмерные изображения тканей на обычных оптических микроскопах. В этом протоколе описаны рекомендации по обеспечению прочного и свободного от трещин расширения тканей, а также советы по обращению и визуализации сильно расширенных гелей.
Биологические системы демонстрируют структурную гетерогенность, начиная от конечностей и органов и заканчивая уровнями белков на наноуровне. Таким образом, полное понимание работы этих систем требует визуального осмотра в этих размерных масштабах. Однако дифракционный предел света вызывает трудности при визуализации структур размером менее ~200-300 нм с помощью обычного флуоресцентного микроскопа. Кроме того, оптические методысверхвысокого разрешения 1,2,3, такие как истощение вынужденного излучения (STED), фотоактивируемая локализационная микроскопия (PALM), стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (STORM) и микроскопия структур....
Все экспериментальные процедуры с участием животных проводились в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения (NIH) и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Карнеги-Меллона. Образцы тканей человека были получены в промышленных масштабах.
1. Приготовление исходных реагентов и растворов
ПРИМЕЧАНИЕ: Список используемых реагентов см. в таблице материалов .
Если протокол был успешно завершен (рис. 1), образец будет выглядеть чистым и плоским после термической денатурации; Любая складка или сморщивание указывает на неполную гомогенизацию. Успешно расширенный образец будет в 3-4,5 раза больше, чем до расширения в 1x PBS, и в 8-11 раз ?.......
Здесь мы представляем протокол Magnify 17, вариант ExM, который может удерживать несколько биомолекул с помощью одного химического якоря и расширять сложные клинические образцы FFPE до11 раз с помощью тепловой денатурации. Ключевые изменения в этом протоколе, которые отличают его .......
Авторы заявляют о следующих конкурирующих финансовых интересах: Y.Z., A.K., Z.C. и B.R.G. изобрели несколько изобретений, связанных с Magnify и ExM.
Эта работа была поддержана Университетом Карнеги-Меллона и Благотворительным фондом D.S.F. (Y.Z. и X.R.), Национальными институтами здравоохранения (N.I.H.) Премия режиссера «Новый инноватор» DP2 OD025926-01 и Фонд Кауфмана.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M | VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
Forceps | |||
Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
Orbital Shaker | |||
Paint brush | |||
pH Meter | |||
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены