Retención molecular universal con microscopía de expansión de 11 veces

Resumen

Aquí se presenta una nueva versión de microscopía de expansión (ExM), Magnify, que está modificada para una expansión de hasta 11 veces, conservando una amplia gama de clases de biomoléculas y es compatible con una amplia gama de tipos de tejidos. Permite la interrogación de la configuración a nanoescala de biomoléculas utilizando microscopios convencionales limitados por difracción.

Resumen

Las imágenes a nanoescala de especímenes biológicos pueden mejorar la comprensión de la patogénesis de la enfermedad. En los últimos años, se ha demostrado que la microscopía de expansión (ExM) es una alternativa eficaz y de bajo coste a la microscopía óptica de superresolución. Sin embargo, se ha visto limitado por la necesidad de agentes de anclaje específicos y, a menudo, personalizados para retener diferentes clases de biomoléculas dentro del gel y por las dificultades para expandir los formatos de muestras clínicas estándar, como el tejido fijado en formol e incluido en parafina, especialmente si se desean factores de expansión más grandes o epítopos de proteínas preservados. Aquí, describimos Magnify, un nuevo método ExM para una expansión robusta de hasta 11 veces en una amplia gama de tipos de tejidos. Al utilizar metacroleína como anclaje químico entre el tejido y el gel, Magnify retiene múltiples biomoléculas, como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, dentro del gel, lo que permite la obtención de imágenes a nanoescala de los tejidos en microscopios ópticos convencionales. Este protocolo describe las mejores prácticas para garantizar una expansión de tejido robusta y sin grietas, así como consejos para manipular y obtener imágenes de geles altamente expandidos.

Introducción

Los sistemas biológicos exhiben heterogeneidad estructural, desde las extremidades y los órganos hasta los niveles de proteínas a nanoescala. Por lo tanto, una comprensión completa del funcionamiento de estos sistemas requiere un examen visual a través de estas escalas de tamaño. Sin embargo, el límite de difracción de la luz causa desafíos en la visualización de estructuras más pequeñas que ~200-300 nm en un microscopio de fluorescencia convencional. Además, los métodos ópticos de superresolución ^1,2,3, como el agotamiento de la emisión estimulada (STED), la microscopía de localización fotoactivada (PALM), la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) y la microscopía de iluminación estructurada (SIM), aunque potentes, presentan sus propios desafíos, ya que requieren hardware y reactivos costosos y, a menudo, tienen tiempos de adquisición lentos y una capacidad deficiente para obtener imágenes de grandes volúmenes en 3D.

La microscopía de expansión⁴ (ExM) proporciona un medio alternativo para eludir el límite de difracción de la luz mediante el anclaje covalente de biomoléculas en un gel polimérico hinchable en agua y separarlas físicamente, lo que las hace resolubles en microscopios ópticos convencionales. Desde la publicación original de ExM hace menos de una década, se han desarrollado multitud de variantes del protocolo ExM, y estos protocolos permiten la incorporación directa de las proteínas ^5,6,7, ARN 8,9,10 o lípidos^11,12,13 en la red de gel alterando el anclaje químico o expandiendo aún más la muestra (mejorando así la resolución efectiva), ya sea en un solo paso¹⁴ o en múltiples pasos iterativos^15,16. Hasta hace poco, ningún protocolo ExM podía retener estas tres clases de biomoléculas con un solo anclaje químico disponible comercialmente, al tiempo que proporcionaba un gel mecánicamente resistente que podía expandirse ~ 10 veces en una sola ronda de expansión.

Aquí, presentamos Magnify¹⁷, una adición reciente al arsenal de ExM que utiliza metacroleína como ancla de biomolécula. La metacroleína forma enlaces covalentes con el tejido como el del paraformaldehído, lo que garantiza que se puedan retener múltiples clases de biomoléculas dentro de la red de gel sin necesidad de varios agentes de anclaje específicos o personalizados. Además, esta técnica puede expandir un amplio espectro de tejidos hasta 11 veces, incluidas muestras notoriamente desafiantes, como las muestras clínicas fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE). Los métodos anteriores para expandir muestras mecánicamente rígidas requerían una digestión dura de las proteasas, lo que hacía imposible el marcaje de anticuerpos de las proteínas de interés después de que la muestra se había expandido. Por el contrario, esta técnica logra la expansión de muestras clínicas FFPE utilizando una solución desnaturalizante en caliente, preservando así los epítopos de proteínas enteras dentro del gel, que pueden ser dirigidos para la obtención de imágenes posteriores a la expansión (Figura 1).

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Carnegie Mellon. Se obtuvieron muestras de tejido humano de forma comercial.

1. Preparación de los reactivos y soluciones madre

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de los reactivos utilizados.

1. Prepare las soluciones madre gelificantes. Estos se combinarán inmediatamente antes del paso de gelificación.
   1. Preparar la solución madre monómera (4 g/100 mL DE ÁCIDO N,N-dimetilacrilamida [DMAA], 50 g/100 ml de acrilato de sodio [SA], 66,7 g/100 ml de acrilamida [AA], 0,10 g/100 ml de N,N′-metilenebisacrilamida [Bis], 33 g/100 ml de cloruro de sodio [NaCl], 1x solución salina tamponada con fosfato; PBS) utilizando los componentes enumerados en la Tabla 1. Disolver o diluir todas las soluciones madre en agua. La solución madre de monómero puede almacenarse a 4 °C durante al menos 3 meses.
   2. Envasar las siguientes soluciones madre por separado en agua: 4-Hidroxi-TEMPO (4HT) al 0,5% (p/p), que inhibe la gelificación durante la difusión del monómero en los tejidos, y tetrametilenilendiamina (TEMED) al 10% (p/p), que acelera la generación de radicales iniciada por el persulfato de amonio (APS) y se prepara al 10% (p/p).
      NOTA: Las soluciones madre pueden distribuirse en alícuotas de 1-2 ml y almacenarse a 4 °C durante un máximo de 3 meses; sin embargo, el APS se realiza inmediatamente antes de preparar la solución gelificante.
2. Prepare el tampón de homogeneización (1% p/v de S.D.S., 8 M de urea, 25 mM de EDTA, 2x PBS, pH 8, a temperatura ambiente [R.T.]) combinando 1 g de SDS, 48,048 g de urea, 5 mL de EDTA (0,5M, pH 8), 20 mL de 10x PBS, 25 mL de Tris (2 M) y 0,75 g de glicina. Agregue agua hasta obtener un volumen total de 100 ml. La solución se puede ampliar o reducir según sea necesario y se puede almacenar en R.T.

2. Preparación de tejidos para portaobjetos de tejidos clínicos archivados y recién preparados

NOTA: Los pasos de preprocesamiento de tejidos difieren según la forma en que se preparen las muestras.

1. En el caso de las muestras clínicas incluidas en parafina fijadas en formaldehído (FFPE), siga los pasos que se indican a continuación.
   1. Coloque las muestras en una serie secuencial de soluciones (se puede usar un frasco de tinción de vidrio o un tubo cónico de 50 ml): xileno, etanol al 95%, etanol al 70% y etanol al 50%, seguido de agua doblemente desionizada. Use cada solución dos veces durante al menos 3 minutos cada vez. Use fórceps para colocar el portaobjetos en el recipiente y agregue 15 ml de la solución respectiva (suficiente para cubrir la muestra). Coloque el tubo cónico tapado horizontalmente en un agitador a temperatura ambiente.
2. Para muestras teñidas y montadas en portaobjetos permanentes, siga los pasos a continuación.
   1. Coloque el portaobjetos brevemente en xileno y retire con cuidado los cubreobjetos con una herramienta adecuada, como una cuchilla de afeitar. Si el cubreobjetos permanece atascado, vuelva a colocar los portaobjetos en xileno a temperatura ambiente hasta que se afloje.
   2. A continuación, procese las muestras como muestras FFPE (paso 2.1.1).
      NOTA: En el caso de los portaobjetos teñidos con hematoxilina y eosina (H&E), la tinción de hematoxilina y eosina se pierde durante el proceso de expansión.
3. Para portaobjetos de tejido congelado no fijados en solución de temperatura óptima de corte (OCT), fije los tejidos en acetona a -20 °C durante 10 min antes de lavar las muestras con 1x solución de PBS tres veces durante 10 min cada vez a temperatura ambiente.
4. En el caso de los portaobjetos de tejido clínico congelados previamente fijados, derrita la OCT incubando los portaobjetos durante 2 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, lávelos con 1 solución de PBS tres veces durante 5 minutos cada vez a temperatura ambiente.

3. Preparación de tejidos para cerebro de ratón fijado en paraformaldehído

1. Siga este protocolo para secciones de cerebro de ratón de 30-50 μm de grosor.
   NOTA: Se puede tener éxito con secciones más grandes, pero es posible que se requieran tiempos más largos para la difusión y homogeneización de la solución de monómero.
2. Si las secciones no están almacenadas actualmente en una solución de 1x PBS (por ejemplo, en una solución de glicerol al 30% [v/v] y etilenglicol al 30% [v/v] en 1x PBS), lávese tres veces durante al menos 10 minutos cada vez a temperatura ambiente en 1x PBS en una placa de 6 a 24 pocillos.
3. Obtenga un portaobjetos de microscopía de vidrio sin recubrimiento. Si un lado del portaobjetos de vidrio está recubierto, use un pincel húmedo para verificar el lado no recubierto (a menudo, la etiqueta del lado recubierto estará hecha de vidrio esmerilado y se volverá menos opaca cuando esté mojada).
4. Usa un pincel para humedecer el portaobjetos sin recubrimiento. Retire el tejido cerebral del ratón de la placa de pocillos con el pincel y colóquelo con cuidado en el portaobjetos, con un movimiento giratorio para asegurarse de que el tejido esté plano. Deje que el exceso de PBS permanezca en el tejido hasta que todas las secciones estén montadas.
   NOTA: Si bien se puede usar un solo portaobjetos de vidrio para múltiples secciones de tejido, cuando se gelifican más secciones de tejido a la vez (incluso en portaobjetos separados), se debe tener más cuidado para asegurarse de que no se sequen por completo.
5. Con un paño de papel de laboratorio, retire la mayor parte del exceso de PBS del portaobjetos. Deja un pequeño anillo líquido alrededor de cada sección de tejido, pero deja el resto del portaobjetos casi seco. Este líquido restante cubrirá el tejido mientras se prepara la solución de monómero en gel.

4. Gelificación

NOTA: Este protocolo es adecuado para todos los tipos de tejidos preparados para su uso con esta técnica.

1. Aplique espaciadores a ambos lados de la sección de tejido (Figura 2A) para evitar la compresión del tejido. Para hacerlo, haga los espaciadores cortando finamente trozos de cubreobjetos con un bolígrafo con punta de diamante, y luego asegúrelos al portaobjetos con pequeñas cantidades de agua o 1x PBS, o fíjelos con una pequeña cantidad de superpegamento. A continuación, coloque suavemente los espaciadores a ambos lados del pañuelo.
2. Preparar la solución gelificante final. Generalmente, ~200 μL es suficiente por sección de tejido, pero el volumen no debe exceder los 800 μL por portaobjetos. Cualquier solución gelificante adicional provocará derrames.
   NOTA: La metacroleína se utiliza para anclar biomoléculas en el gel. Sin embargo, no se requiere ningún paso de anclaje por separado, y la metacroleína se puede agregar directamente a la solución gelificante final.
   1. Por sección, combine lo siguiente en orden: 200 μL de solución de monómero, 0,5 μL de solución madre 4HT al 0,5% (dilución 1:400), 0,2-0,5 μL de metacroleína (dilución 1:400-1:1.000 dependiendo del tipo de tejido; generalmente, utilice una dilución 1:1.000 para muestras fijadas con paraformaldehído [PFA] y 1:400 para muestras clínicas FFPE), 2 μL de solución madre TEMED al 10% (dilución 1:100), y 5 μL de solución madre de A.P.S. al 10% (dilución 1:40).
      NOTA: Prepare la solución gelificante final inmediatamente antes de usarla. Para evitar la gelificación prematura, agregue la solución APS al final.
3. Retire el exceso de solución de la sección de tejido y coloque el portaobjetos en una placa de Petri. Añadir a la muestra toda la solución gelificante fría recién preparada e incubar la mezcla en el tejido durante 30 min a 4 °C para permitir su difusión en el tejido.
4. Coloque un segundo portaobjetos de vidrio sin recubrimiento con cuidado sobre el pañuelo y la solución de gel. Deben evitarse las burbujas de aire (Figura 2B).
   NOTA: Si las burbujas de aire quedan atrapadas sobre el pañuelo, la tapa de vidrio puede levantarse con cuidado y volver a colocarse. Además, cualquier solución de monómero que se derrame puede recortarse después de la polimerización y no causará ningún problema para el tejido.
5. Asegúrese de que se complete la polimerización. Esta polimerización se puede realizar de dos maneras, cada una de las cuales produce resultados similares. En primer lugar, incubar las muestras a 37 °C en un ambiente humidificado (como una placa de Petri cerrada con una toalla de papel húmeda) durante la noche. Alternativamente, para una polimerización más rápida, incubar las muestras en la atmósfera humidificada durante 2 h a 37 °C seguido de 1 h a 60 °C.

5. Digestión de la muestra y expansión del tejido

NOTA: Este protocolo es adecuado para todo tipo de tejidos.

1. Con protección para los ojos, deslice una hoja de afeitar entre los dos portaobjetos de vidrio de la cámara de gelificación para separarlos.
   NOTA: Los portaobjetos de vidrio deben separarse muy fácilmente. Si diferentes partes del gel están pegadas a ambos portaobjetos, se puede usar un pincel para guiar el gel hacia uno u otro. Si el gel se ha vuelto particularmente seco durante la polimerización, se puede aplicar 1x PBS en el exterior de la cámara de gel, pero no sumerja el gel por completo, ya que esto hará que se expanda antes de que el tejido se homogeneice, lo que provocará grietas.
2. Recorta el gel en blanco alrededor del pañuelo para minimizar el volumen. Cortar el gel de forma asimétrica permite el seguimiento de la orientación del gel después de la homogeneización, ya que la muestra será completamente transparente.
3. Levante suavemente el gel que contiene pañuelos del portaobjetos con una cuchilla de afeitar y transfiéralo suavemente a un tubo de centrífuga de 2 ml con una brocha.
4. Llene el tubo hasta la parte superior con tampón de homogeneización (Tabla 2) precalentado a 80 °C.
5. Incubar la muestra agitándola a 80 °C durante 8 h (para el cerebro de ratón fijado con PFA) o 60 h (la mayoría de las muestras clínicas FFPE; ver Tabla 3).
   NOTA: El tiempo de homogeneización depende del tipo de tejido y del método de fijación. Muchas de estas condiciones ya han sido validadas, pero para otras, la optimización puede ser necesaria.
6. Vierta el contenido del tubo de centrífuga en un solo pocillo de una placa de cultivo celular de plástico de 6 pocillos.
7. Retire el tampón de desnaturalización con una pipeta de transferencia.
8. Para eliminar completamente la FDS restante del hidrogel, lavar la muestra en una solución de tensioactivo no iónico al 1% (C₁₂E 10) de la siguiente manera: al menos tres veces durante₁₀ minutos cada vez a temperatura ambiente; durante 60 min a 60 °C; y luego otros tres lavados durante 10 minutos cada vez a temperatura ambiente.
9. Almacene la muestra en 1x PBS + azida sódica al 0,02% a 4 °C hasta que sea necesario realizar la tinción posterior a la expansión y la obtención de imágenes.
   NOTA: En este punto, la muestra debe ser ~3-4.5 veces más grande en cada dimensión, dependiendo del tipo de tejido.

6. Perfil de biomoléculas post-expansión

1. Tinción de anticuerpos
   NOTA: Esto sigue un protocolo típico de tinción de inmunofluorescencia (FI)/inmunohistoquímica (IHC). Las cantidades de anticuerpos primarios y secundarios utilizados dependen de las concentraciones sugeridas por el fabricante o de la optimización para el experimento específico. Los búferes individuales pueden ser sustituidos a discreción del usuario.
   1. Con la muestra en un solo pocillo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos, lavar las muestras expandidas tres veces durante 10 minutos cada vez en 1x PBS en R.T., transfiriendo el líquido con una pipeta.
   2. Realice un paso de bloqueo opcional (por ejemplo, 3 % de albúmina sérica bovina/0,1 % de Triton-X100 en 1x PBS) durante al menos 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
   3. Incubar con los anticuerpos primarios en tampón de tinción (por ejemplo, Triton-X100 al 0,1 % 1x PBS o 9 veces PBS/TritonX al 1 %/10 mg/L de heparina) durante la noche a 37 °C. Dependiendo del tamaño de la muestra, 0,5-2 ml deberían cubrir adecuadamente el gel.
   4. Lave la muestra tres veces durante al menos 10 minutos cada vez en 1x PBS a temperatura ambiente.
   5. Incubar en los anticuerpos secundarios correspondientes durante 3 h a 37 °C en el tampón de tinción de elección.
   6. Lave la muestra tres veces durante al menos 10 minutos cada vez en 1x PBS a temperatura ambiente.
2. Tinción de panproteína de éster NHS
   1. Con la muestra en una placa de 6 pocillos, vierta 1-2 ml de polietilenglicol (PEG 200) sobre la muestra (lo suficiente para cubrirla por completo).
      NOTA: El tejido debe encogerse y volver a su tamaño original antes de la expansión (o cerca de él).
   2. Manchar con éster NHS conjugado con fluoróforos diluido a 13,3-80 μg/ml durante 3 h a R.T. en 1-2 ml de tampón de tinción (por ejemplo, 1x PBS, 2x S.S.C. o 100 mM de solución de bicarbonato de sodio).
   3. Lave la muestra tres veces durante al menos 10 minutos cada vez en 1x PBS a temperatura ambiente.
3. Tinción lipídica
   NOTA: La tinción lipídica posterior a la expansión no es eficaz en muestras clínicas FFPE, ya que los lípidos se pierden durante el proceso de fijación.
   1. Lave la muestra tres veces durante al menos 10 minutos cada vez en 1x PBS a temperatura ambiente.
   2. Aplicar un colorante lipofílico convencional (DiO, DiI o DiD) diluido 200 veces en 2 ml de TritonX-100/1x PBS al 0,1% durante 72-96 h a temperatura ambiente.
   3. Lavar al menos tres veces con 1x PBS
4. Hibridación fluorescente in situ (FISH)
   1. Colocar las muestras de gel homogeneizadas en un tampón de hibridación precalentado a 60 °C durante 30 min.
   2. Prepare el tampón de hibridación para FISH: Combine 2x S.S.C. (300 mM de NaCl, 30 mM de citrato de sodio, pH 7,0), 10% (v/v) de sulfato de dextrano, 20% (v/v) de carbonato de etileno y 0,1% (v/v) de Tween20.
   3. Incubar las muestras de gel con un tampón de hibridación que contenga 10 pM (por oligo) de sondas FISH contra el gen diana (al menos 20 sondas por 10 kb) a 45 °C durante la noche.
   4. Lavar con tampón de lavado estricto (2x S.S.C. y 0,1% Tween20) dos veces durante 15 min cada vez a 45 °C.
   5. Lavar con tampón de lavado estricto otras dos veces durante 10 minutos cada vez a 37 °C.
   6. Finalmente, lavar con 1x PBS al menos tres veces durante 10 minutos cada vez a temperatura ambiente.
   7. Las muestras están listas para la obtención de imágenes o el almacenamiento en 1x PBS + azida sódica al 0,02% a 4 °C.
5. Expansión tisular completa e imágenes de fluorescencia
   NOTA: El factor de expansión que se puede obtener con Magnify varía según el tipo de tejido y el método de expansión (se puede encontrar un resumen completo en la Tabla 3). Sin embargo, como estimación general, una muestra de Magnify se expandirá de 3 a 4,5 veces en 1x PBS, de 5 a 7 veces en PBS diluido a 1:50 en ddH 2O y de 8 a 11 veces en ddH₂O. El factor de expansión óptimo para la obtención de imágenes depende de las necesidades de cada experimento. El factor de expansión es altamente ajustable, de modo que una sola muestra puede expandirse y reducirse muchas veces para obtener imágenes a varias escalas.
   1. Mueva las muestras expandidas 4 veces en PBS a una placa de imágenes de 6 pocillos con fondo de vidrio con un pincel. Mueva cualquier muestra expandida cortándola en trozos más pequeños o colocándola suavemente en una placa grande de imágenes con fondo de vidrio con un trozo delgado de plástico flexible.
   2. Realice imágenes de fluorescencia utilizando un microscopio convencional de campo amplio, un microscopio confocal u otro sistema de imágenes de su elección. Eliminar el exceso de líquido alrededor del gel con un paño de papel de laboratorio puede impedir el movimiento del gel durante la toma de imágenes. Los geles también se pueden inmovilizar aplicando poli-L-lisina al 0,1% a la superficie del vidrio antes de la obtención de imágenes.
      NOTA: La aplicación de poli-L-lisina hará que el gel quede completamente inmóvil al contacto. Por esta razón, se debe tener cuidado de que el gel se aplique al vidrio sin doblarse ni estirarse. Además, no se debe permitir que el gel se seque completamente en el vidrio recubierto de poli-L-lisina, ya que esto podría dificultar la extracción, y el gel no debe encogerse en PBS mientras aún está unido al vidrio con poli-L-lisina, ya que esto podría causar daños en el gel o en los tejidos.
   3. Después de la obtención de imágenes, reduzca las muestras en 1x PBS con al menos tres lavados durante 10 minutos cada vez, ya que no se recomienda almacenar las muestras a largo plazo en ddH₂O debido a la degradación de la señal de fluorescencia. En particular, las muestras completamente expandidas teñidas con colorantes lipofílicos deben tomarse imágenes lo más cerca posible del momento de la expansión para evitar la disociación del colorante en agua.
   4. Almacenar las muestras en 1x PBS + azida sódica al 0,02% a 4 °C.

Resultados

Si el protocolo se ha completado con éxito (Figura 1), la muestra aparecerá clara y plana después de la desnaturalización por calor; Cualquier pliegue o arruga indica una homogeneización incompleta. Una muestra expandida con éxito será de 3 a 4,5 veces más grande que antes de la expansión en 1x PBS y de 8 a 11 veces más grande cuando esté completamente expandida en ddH₂O. La Figura 3 muestra imágenes de ejemplo antes y después de la expan...

Discusión

Aquí, presentamos el protocolo Magnify 17, una variante ExM que puede retener múltiples biomoléculas con un solo anclaje químico y expandir muestras clínicas FFPE desafiantes hasta¹¹ veces con desnaturalización por calor. Los cambios clave en este protocolo que lo distinguen de otros protocolos ExM incluyen el uso de un gel reformulado que permanece mecánicamente robusto incluso cuando está completamente expandido, así como el uso de metacroleína como anclaje de la biomolécula. Los paso...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)	Cellvis	P06-1.5H-N
Acrylamide	Sigma Aldrich	A8887	Gel Monomer component
Ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiatior
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10)	Sigma Aldrich	P9769	Non-ionic surfactant
Diamond knife No. 88 CM	General Tools	31116
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M	VWR	BDH7830-1	Homogenization Buffer Component
Forceps
Glycine	Sigma Aldrich	G8898	Homogenization Buffer Component
Heparin	Sigma Aldrich	H3393
Methacrolein	Sigma Aldrich	133035	Anchoring Agent
Micro cover Glass #1 (24x60mm)	VWR	48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis)	Sigma Aldrich	M7279	Gel Monomer component
N,N-dimethylacrylamide (DMAA)	Sigma Aldrich	274135	Gel Monomer component
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish	Thermo Fisher	167063
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish	Thermo Fisher	140675
Nunc™ 15mL Conical	Thermo Fisher	339651
Nunc™ 50mL Conical	Thermo Fisher	339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution	Fischer Scientific	BP399-1
Polyethylene glycol  200	Sigma Aldrich	P-3015
Proteinase K (Molecular Biology Grade)	Thermo Scientific	EO0491
Razor blade	Fischer Scientifc	12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
Sodium acrylate (SA)	AK Scientific	R624	Gel Monomer component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L3771	Homogenization Buffer Component
Tris Base	Fischer Scientific	BP152-1	Homogenization Buffer Component
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Urea	Sigma Aldrich	U5378	Homogenization Buffer Component
Xylenes	Sigma Aldrich	214736
20x SSC	Thermo Scientific	AM9763
Tween20	Sigma Aldrich	P1379
poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P8920