Retención molecular universal con microscopía de expansión de 11 veces

Resumen

Aquí se presenta una nueva versión de microscopía de expansión (ExM), Magnify, que está modificada para una expansión de hasta 11 veces, conservando una amplia gama de clases de biomoléculas y es compatible con una amplia gama de tipos de tejidos. Permite la interrogación de la configuración a nanoescala de biomoléculas utilizando microscopios convencionales limitados por difracción.

Resumen

Las imágenes a nanoescala de especímenes biológicos pueden mejorar la comprensión de la patogénesis de la enfermedad. En los últimos años, se ha demostrado que la microscopía de expansión (ExM) es una alternativa eficaz y de bajo coste a la microscopía óptica de superresolución. Sin embargo, se ha visto limitado por la necesidad de agentes de anclaje específicos y, a menudo, personalizados para retener diferentes clases de biomoléculas dentro del gel y por las dificultades para expandir los formatos de muestras clínicas estándar, como el tejido fijado en formol e incluido en parafina, especialmente si se desean factores de expansión más grandes o epítopos de proteínas preservados. Aquí, describimos Magnify, un nuevo método ExM para una expansión robusta de hasta 11 veces en una amplia gama de tipos de tejidos. Al utilizar metacroleína como anclaje químico entre el tejido y el gel, Magnify retiene múltiples biomoléculas, como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, dentro del gel, lo que permite la obtención de imágenes a nanoescala de los tejidos en microscopios ópticos convencionales. Este protocolo describe las mejores prácticas para garantizar una expansión de tejido robusta y sin grietas, así como consejos para manipular y obtener imágenes de geles altamente expandidos.

Introducción

Los sistemas biológicos exhiben heterogeneidad estructural, desde las extremidades y los órganos hasta los niveles de proteínas a nanoescala. Por lo tanto, una comprensión completa del funcionamiento de estos sistemas requiere un examen visual a través de estas escalas de tamaño. Sin embargo, el límite de difracción de la luz causa desafíos en la visualización de estructuras más pequeñas que ~200-300 nm en un microscopio de fluorescencia convencional. Además, los métodos ópticos de superresolución ^1,2,3, como el agotamiento de la emisión estimulada (STED), la microscopía de localización fotoactivad....

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Carnegie Mellon. Se obtuvieron muestras de tejido humano de forma comercial.

1. Preparación de los reactivos y soluciones madre

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de los reactivos utilizados.

1. Prepare las soluciones madre gelificantes. Estos se combinarán inmediatamente antes del paso de gelificación.
   1. ....

Resultados

Si el protocolo se ha completado con éxito (Figura 1), la muestra aparecerá clara y plana después de la desnaturalización por calor; Cualquier pliegue o arruga indica una homogeneización incompleta. Una muestra expandida con éxito será de 3 a 4,5 veces más grande que antes de la expansión en 1x PBS y de 8 a 11 veces más grande cuando esté completamente expandida en ddH₂O. La Figura 3 muestra imágenes de ejemplo antes y después de la expan.......

Discusión

Aquí, presentamos el protocolo Magnify 17, una variante ExM que puede retener múltiples biomoléculas con un solo anclaje químico y expandir muestras clínicas FFPE desafiantes hasta¹¹ veces con desnaturalización por calor. Los cambios clave en este protocolo que lo distinguen de otros protocolos ExM incluyen el uso de un gel reformulado que permanece mecánicamente robusto incluso cuando está completamente expandido, así como el uso de metacroleína como anclaje de la biomolécula. Los paso.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)	Cellvis	P06-1.5H-N
Acrylamide	Sigma Aldrich	A8887	Gel Monomer component
Ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiatior
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10)	Sigma Aldrich	P9769	Non-ionic surfactant
Diamond knife No. 88 CM	General Tools	31116
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M	VWR	BDH7830-1	Homogenization Buffer Component
Forceps
Glycine	Sigma Aldrich	G8898	Homogenization Buffer Component
Heparin	Sigma Aldrich	H3393
Methacrolein	Sigma Aldrich	133035	Anchoring Agent
Micro cover Glass #1 (24x60mm)	VWR	48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis)	Sigma Aldrich	M7279	Gel Monomer component
N,N-dimethylacrylamide (DMAA)	Sigma Aldrich	274135	Gel Monomer component
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish	Thermo Fisher	167063
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish	Thermo Fisher	140675
Nunc™ 15mL Conical	Thermo Fisher	339651
Nunc™ 50mL Conical	Thermo Fisher	339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution	Fischer Scientific	BP399-1
Polyethylene glycol  200	Sigma Aldrich	P-3015
Proteinase K (Molecular Biology Grade)	Thermo Scientific	EO0491
Razor blade	Fischer Scientifc	12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
Sodium acrylate (SA)	AK Scientific	R624	Gel Monomer component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L3771	Homogenization Buffer Component
Tris Base	Fischer Scientific	BP152-1	Homogenization Buffer Component
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Urea	Sigma Aldrich	U5378	Homogenization Buffer Component
Xylenes	Sigma Aldrich	214736
20x SSC	Thermo Scientific	AM9763
Tween20	Sigma Aldrich	P1379
poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P8920