Universal Molecular Retention with 11-Fold Expansion Microscopy(11배 팽창 현미경을 통한 범용 분자 유지)

요약

여기에 제시된 확장 현미경(ExM)의 새로운 버전인 Magnify는 최대 11배 확장을 위해 수정되어 포괄적인 생체 분자 클래스 배열을 보존하고 광범위한 조직 유형과 호환됩니다. 이를 통해 기존의 회절 제한 현미경을 사용하여 생체 분자의 나노 크기 구성을 조사할 수 있습니다.

초록

생물학적 표본의 나노스케일 이미징은 질병 발병기전에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다. 최근 몇 년 동안 팽창 현미경(ExM)은 광학 초고해상도 현미경에 대한 효과적이고 저렴한 대안으로 입증되었습니다. 그러나 겔 내에서 서로 다른 생체 분자 클래스를 유지하기 위한 특이적이고 종종 맞춤형 앵커링제의 필요성과 특히 더 큰 확장 인자 또는 보존된 단백질 에피토프가 필요한 경우 포르말린 고정 파라핀 포매 조직과 같은 표준 임상 샘플 형식을 확장하는 데 어려움이 있기 때문에 제한되었습니다. 여기에서는 다양한 조직 유형에서 최대 11배까지 강력하게 확장할 수 있는 새로운 ExM 방법인 Magnify에 대해 설명합니다. Magnify는 메타크롤레인을 조직과 겔 사이의 화학적 앵커로 사용함으로써 단백질, 지질 및 핵산과 같은 여러 생체 분자를 겔 내에 보유하므로 기존 광학 현미경에서 조직의 광범위한 나노 스케일 이미징이 가능합니다. 이 프로토콜은 견고하고 균열 없는 조직 확장을 보장하기 위한 모범 사례와 고도로 확장된 젤을 취급하고 이미징하기 위한 팁을 설명합니다.

서문

생물학적 시스템은 팔다리와 장기에서 나노 규모의 단백질 수준에 이르기까지 구조적 이질성을 나타냅니다. 따라서 이러한 시스템의 작동을 완전히 이해하려면 이러한 크기 척도에 대한 육안 검사가 필요합니다. 그러나 빛의 회절 한계는 기존 형광 현미경에서 ~200-300nm보다 작은 구조를 시각화하는 데 어려움을 야기합니다. 또한 STED(Stimulated Emission Depletion), PALM(Photo-Activated Localization Microscopy), STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) 및 SIM(Structured Illumination Microscopy)과 같은 광학 초^{해상도 방법(1,2,3})은 강력하지만 값비싼 하드웨어와 시약이 필요하고 종종 획득 시간이 느리고 3D로 대량을 이미지화하는 능력이 떨어지기 때문에 고유한 문제를 제시합니다.

팽창 현미경⁴(ExM)는 생체 분자를 팽윤성 폴리머 겔에 공유 결합하고 물리적으로 분리하여 기존 광학 현미경에서 분해할....

프로토콜

동물과 관련된 모든 실험 절차는 NIH(National Institutes of Health) 지침에 따라 수행되었으며 카네기 멜론 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 인간 조직 샘플을 상업적으로 입수하였다.

1. 원유 시약 및 용액의 준비

참고: 사용된 시약 목록은 재료 표를 참조하십시오.

1. 겔화 원액을 준비합니다. 이들은 겔화 단계 직전에 결합됩니다.
   1. 단량체 원액(4g/100mL N,N-디메틸아크릴아미드산[DMAA], 50g/100mL 아크릴산나트륨[SA], 66.7g/100mL 아크릴아미드[AA], 0.10g/100mL N,N'-메틸렌비스아크릴아미드[Bis], 33g/100mL 염화나트륨[NaCl], 1x 인산염 완충 식염수; PBS)를 사용하여 표 1에 열거된 성분을 이용하였다. 모든 원액을 물에 녹이거나 희석하십시오. 단량체 원액은 4°C에서 최소 3개월 동안 보관할 수 있습니다.
   2. 단량체가 조직으로 확산되는 동안 겔화를 억제하는 0.5%(w/w) 4-Hydroxy-TEMPO(4HT) 및 10%(w/w) 과황산암모늄(APS)....

토론

여기에서는 단일 화학 앵커로 여러 생체 분자를 유지하고 열 변성으로 까다로운 FFPE 임상 표본을 최대 11배까지 확장할 수 있는 ExM 변이체인 Magnify 프로토콜¹⁷을 제시합니다. 다른 ExM 프로토콜과 구별되는 이 프로토콜의 주요 변경 사항에는 완전히 확장된 경우에도 기계적으로 견고하게 유지되는 재구성된 젤의 사용과 생체 분자 앵커로 메타크롤레인의 사용이 포함됩니다. 이 프?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)	Cellvis	P06-1.5H-N
Acrylamide	Sigma Aldrich	A8887	Gel Monomer component
Ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiatior
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10)	Sigma Aldrich	P9769	Non-ionic surfactant
Diamond knife No. 88 CM	General Tools	31116
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M	VWR	BDH7830-1	Homogenization Buffer Component
Forceps
Glycine	Sigma Aldrich	G8898	Homogenization Buffer Component
Heparin	Sigma Aldrich	H3393
Methacrolein	Sigma Aldrich	133035	Anchoring Agent
Micro cover Glass #1 (24x60mm)	VWR	48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis)	Sigma Aldrich	M7279	Gel Monomer component
N,N-dimethylacrylamide (DMAA)	Sigma Aldrich	274135	Gel Monomer component
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish	Thermo Fisher	167063
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish	Thermo Fisher	140675
Nunc™ 15mL Conical	Thermo Fisher	339651
Nunc™ 50mL Conical	Thermo Fisher	339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution	Fischer Scientific	BP399-1
Polyethylene glycol  200	Sigma Aldrich	P-3015
Proteinase K (Molecular Biology Grade)	Thermo Scientific	EO0491
Razor blade	Fischer Scientifc	12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
Sodium acrylate (SA)	AK Scientific	R624	Gel Monomer component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L3771	Homogenization Buffer Component
Tris Base	Fischer Scientific	BP152-1	Homogenization Buffer Component
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Urea	Sigma Aldrich	U5378	Homogenization Buffer Component
Xylenes	Sigma Aldrich	214736
20x SSC	Thermo Scientific	AM9763
Tween20	Sigma Aldrich	P1379
poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P8920