Universelle molekulare Retention mit 11-facher Expansionsmikroskopie

Zusammenfassung

Hier wird eine neue Version der Expansionsmikroskopie (ExM), Magnify, vorgestellt, die für eine bis zu 11-fache Expansion modifiziert wurde, eine umfassende Palette von Biomolekülklassen bewahrt und mit einer Vielzahl von Gewebetypen kompatibel ist. Es ermöglicht die Untersuchung der nanoskaligen Konfiguration von Biomolekülen mit herkömmlichen beugungsbegrenzten Mikroskopen.

Zusammenfassung

Die nanoskalige Bildgebung biologischer Proben kann das Verständnis der Krankheitspathogenese verbessern. In den letzten Jahren hat sich die Expansionsmikroskopie (ExM) als effektive und kostengünstige Alternative zur optischen Superauflösungsmikroskopie erwiesen. Sie wurde jedoch durch den Bedarf an spezifischen und oft kundenspezifischen Verankerungsmitteln zur Beibehaltung verschiedener Biomolekülklassen im Gel und durch Schwierigkeiten bei der Erweiterung klinischer Standardprobenformate, wie z. B. formalinfixiertes, in Paraffin eingebettetes Gewebe, eingeschränkt, insbesondere wenn größere Expansionsfaktoren oder konservierte Proteinepitope gewünscht werden. Hier beschreiben wir Magnify, eine neue ExM-Methode zur robusten bis zu 11-fachen Expansion in einer Vielzahl von Gewebetypen. Durch die Verwendung von Methacrolein als chemischer Anker zwischen dem Gewebe und dem Gel hält Magnify mehrere Biomoleküle wie Proteine, Lipide und Nukleinsäuren im Gel zurück und ermöglicht so die breite nanoskalige Abbildung von Geweben auf herkömmlichen optischen Mikroskopen. Dieses Protokoll beschreibt Best Practices, um eine robuste und rissfreie Gewebeexpansion zu gewährleisten, sowie Tipps für die Handhabung und Bildgebung von stark expandierten Gelen.

Einleitung

Biologische Systeme weisen strukturelle Heterogenität auf, von den Gliedmaßen und Organen bis hin zu Proteinen auf der Nanoskala. Daher erfordert ein vollständiges Verständnis der Funktionsweise dieser Systeme eine visuelle Untersuchung über diese Größenskalen hinweg. Die Beugungsgrenze des Lichts stellt jedoch eine Herausforderung bei der Visualisierung von Strukturen dar, die kleiner als ~200-300 nm auf einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop sind. Darüber hinaus stellen optische Superauflösungsmethoden ^1,2,3, wie z. B. die stimulierte Emissionsverarmung (STED), die photoaktivierte Lokalisierungsmikroskopie (PALM), die ....

Protokoll

Alle Versuchsverfahren mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Carnegie Mellon University genehmigt. Menschliche Gewebeproben wurden kommerziell gewonnen.

1. Herstellung der Stammreagenzien und -lösungen

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie eine Liste der verwendeten Reagenzien.

1. Bereiten Sie die Gelierstocklösungen vor. Diese werden unmittelbar vor dem Gelierschritt kombiniert.
   1. Die Monomer-Stammlösung (4 g/100 mL N,N-Dimethylacrylami....

Diskussion

Hier stellen wir das Magnify-Protokoll¹⁷ vor, eine ExM-Variante, die mehrere Biomoleküle mit einem einzigen chemischen Anker zurückhalten und anspruchsvolle klinische FFPE-Proben durch Hitzedenaturierung bis zu 11-fach erweitern kann. Zu den wichtigsten Änderungen in diesem Protokoll, die es von anderen ExM-Protokollen unterscheiden, gehören die Verwendung eines neu formulierten Gels, das auch bei vollständiger Expansion mechanisch robust bleibt, sowie die Verwendung von Methacrolein als Biom.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)	Cellvis	P06-1.5H-N
Acrylamide	Sigma Aldrich	A8887	Gel Monomer component
Ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiatior
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10)	Sigma Aldrich	P9769	Non-ionic surfactant
Diamond knife No. 88 CM	General Tools	31116
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M	VWR	BDH7830-1	Homogenization Buffer Component
Forceps
Glycine	Sigma Aldrich	G8898	Homogenization Buffer Component
Heparin	Sigma Aldrich	H3393
Methacrolein	Sigma Aldrich	133035	Anchoring Agent
Micro cover Glass #1 (24x60mm)	VWR	48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis)	Sigma Aldrich	M7279	Gel Monomer component
N,N-dimethylacrylamide (DMAA)	Sigma Aldrich	274135	Gel Monomer component
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish	Thermo Fisher	167063
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish	Thermo Fisher	140675
Nunc™ 15mL Conical	Thermo Fisher	339651
Nunc™ 50mL Conical	Thermo Fisher	339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution	Fischer Scientific	BP399-1
Polyethylene glycol  200	Sigma Aldrich	P-3015
Proteinase K (Molecular Biology Grade)	Thermo Scientific	EO0491
Razor blade	Fischer Scientifc	12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
Sodium acrylate (SA)	AK Scientific	R624	Gel Monomer component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L3771	Homogenization Buffer Component
Tris Base	Fischer Scientific	BP152-1	Homogenization Buffer Component
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Urea	Sigma Aldrich	U5378	Homogenization Buffer Component
Xylenes	Sigma Aldrich	214736
20x SSC	Thermo Scientific	AM9763
Tween20	Sigma Aldrich	P1379
poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P8920