Universelle molekulare Retention mit 11-facher Expansionsmikroskopie

Zusammenfassung

Hier wird eine neue Version der Expansionsmikroskopie (ExM), Magnify, vorgestellt, die für eine bis zu 11-fache Expansion modifiziert wurde, eine umfassende Palette von Biomolekülklassen bewahrt und mit einer Vielzahl von Gewebetypen kompatibel ist. Es ermöglicht die Untersuchung der nanoskaligen Konfiguration von Biomolekülen mit herkömmlichen beugungsbegrenzten Mikroskopen.

Zusammenfassung

Die nanoskalige Bildgebung biologischer Proben kann das Verständnis der Krankheitspathogenese verbessern. In den letzten Jahren hat sich die Expansionsmikroskopie (ExM) als effektive und kostengünstige Alternative zur optischen Superauflösungsmikroskopie erwiesen. Sie wurde jedoch durch den Bedarf an spezifischen und oft kundenspezifischen Verankerungsmitteln zur Beibehaltung verschiedener Biomolekülklassen im Gel und durch Schwierigkeiten bei der Erweiterung klinischer Standardprobenformate, wie z. B. formalinfixiertes, in Paraffin eingebettetes Gewebe, eingeschränkt, insbesondere wenn größere Expansionsfaktoren oder konservierte Proteinepitope gewünscht werden. Hier beschreiben wir Magnify, eine neue ExM-Methode zur robusten bis zu 11-fachen Expansion in einer Vielzahl von Gewebetypen. Durch die Verwendung von Methacrolein als chemischer Anker zwischen dem Gewebe und dem Gel hält Magnify mehrere Biomoleküle wie Proteine, Lipide und Nukleinsäuren im Gel zurück und ermöglicht so die breite nanoskalige Abbildung von Geweben auf herkömmlichen optischen Mikroskopen. Dieses Protokoll beschreibt Best Practices, um eine robuste und rissfreie Gewebeexpansion zu gewährleisten, sowie Tipps für die Handhabung und Bildgebung von stark expandierten Gelen.

Einleitung

Biologische Systeme weisen strukturelle Heterogenität auf, von den Gliedmaßen und Organen bis hin zu Proteinen auf der Nanoskala. Daher erfordert ein vollständiges Verständnis der Funktionsweise dieser Systeme eine visuelle Untersuchung über diese Größenskalen hinweg. Die Beugungsgrenze des Lichts stellt jedoch eine Herausforderung bei der Visualisierung von Strukturen dar, die kleiner als ~200-300 nm auf einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop sind. Darüber hinaus stellen optische Superauflösungsmethoden ^1,2,3, wie z. B. die stimulierte Emissionsverarmung (STED), die photoaktivierte Lokalisierungsmikroskopie (PALM), die stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) und die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM), zwar ihre eigenen Herausforderungen dar, da sie teure Hardware und Reagenzien erfordern und oft langsame Aufnahmezeiten und eine schlechte Fähigkeit haben, große Mengen in ^3D abzubilden.

Die Expansionsmikroskopie⁴ (ExM) bietet eine alternative Möglichkeit, die Beugungsgrenze des Lichts zu umgehen, indem Biomoleküle kovalent in einem wasserquellfähigen Polymergel verankert und physikalisch auseinandergezogen werden, wodurch sie auf herkömmlichen optischen Mikroskopen auflösbar werden. Seit der ursprünglichen Veröffentlichung von ExM vor weniger als einem Jahrzehnt wurde eine Vielzahl von ExM-Protokollvarianten entwickelt, die den direkten Einbau der Proteine ^5,6,7, RNA 8,9,10 oder Lipide^11,12,13 ermöglichen in das Gelnetzwerk durch Verändern des chemischen Ankers oder weiteres Erweitern der Probe (wodurch die effektive Auflösung verbessert wird) entweder in einem einzigen Schritt¹⁴ oder in mehreren iterativen Schritten^15,16. Bis vor kurzem konnte kein einzelnes ExM-Protokoll diese drei Biomolekülklassen mit einem einzigen kommerziell erhältlichen chemischen Anker beibehalten und gleichzeitig ein mechanisch robustes Gel bereitstellen, das sich in einer einzigen Expansionsrunde ~10-fach ausdehnen konnte.

Hier stellen wir Magnify¹⁷ vor, eine neue Ergänzung des ExM-Arsenals, die Methacrolein als Biomolekülanker verwendet. Methacrolein bildet kovalente Bindungen mit Gewebe wie Paraformaldehyd und stellt sicher, dass mehrere Klassen von Biomolekülen innerhalb des Gelnetzwerks erhalten bleiben können, ohne dass verschiedene spezifische oder kundenspezifische Verankerungsmittel erforderlich sind. Darüber hinaus kann diese Technik ein breites Spektrum von Geweben um das bis zu 11-fache erweitern, einschließlich notorisch schwieriger Proben wie formalinfixierte, paraffineingebettete (FFPE) klinische Proben. Bisherige Methoden zur Expansion solcher mechanisch starren Proben erforderten einen harten Proteaseverstand, was die Antikörpermarkierung von Proteinen von Interesse nach der Expansion der Probe unmöglich machte. Im Gegensatz dazu wird mit dieser Technik die Expansion klinischer FFPE-Proben mit einer heißen Denaturierungslösung erreicht, wodurch ganze Proteinepitope im Gel erhalten bleiben, die für die Bildgebung nach der Expansion gezielt eingesetzt werden können (Abbildung 1).

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Protokoll

Alle Versuchsverfahren mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Carnegie Mellon University genehmigt. Menschliche Gewebeproben wurden kommerziell gewonnen.

1. Herstellung der Stammreagenzien und -lösungen

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie eine Liste der verwendeten Reagenzien.

1. Bereiten Sie die Gelierstocklösungen vor. Diese werden unmittelbar vor dem Gelierschritt kombiniert.
   1. Die Monomer-Stammlösung (4 g/100 mL N,N-Dimethylacrylamidsäure [DMAA], 50 g/100 mL Natriumacrylat [SA], 66,7 g/100 mL Acrylamid [AA], 0,10 g/100 mL N,N′-Methylenbisacrylamid [Bis], 33 g/100 mL Natriumchlorid [NaCl], 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung; PBS) unter Verwendung der in Tabelle 1 aufgeführten Komponenten. Lösen oder verdünnen Sie alle Stammlösungen in Wasser. Die Monomerstammlösung kann bei 4 °C mindestens 3 Monate gelagert werden.
   2. Stellen Sie die folgenden Stammlösungen separat in Wasser her: 0,5 % (w/w) 4-Hydroxy-TEMPO (4HT), das die Gelierung während der Monomerdiffusion in das Gewebe hemmt, und 10 % (w/w) Tetramethylethylendiamin (TEMED), das die durch Ammoniumpersulfat (APS) initiierte Radikalbildung beschleunigt und zu 10 % (w/w) hergestellt wird.
      HINWEIS: Die Stammlösungen können in 1-2 ml Aliquots verteilt und bei 4 °C bis zu 3 Monate gelagert werden. APS wird jedoch unmittelbar vor der Herstellung der Gelierlösung durchgeführt.
2. Bereiten Sie den Homogenisierungspuffer (1 % w/v S.D.S., 8 M Harnstoff, 25 mM EDTA, 2x PBS, pH 8, bei Raumtemperatur [R.T.]) vor, indem Sie 1 g SDS, 48,048 g Harnstoff, 5 ml EDTA (0,5 m, pH 8), 20 ml 10x PBS, 25 ml Tris (2 M) und 0,75 g Glycin kombinieren. Fügen Sie Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 100 ml zu erhalten. Die Lösung kann je nach Bedarf vergrößert oder verkleinert und bei R.T. gelagert werden.

2. Gewebepräparation für archivierte und frisch präparierte klinische Gewebeobjektträger

HINWEIS: Die Schritte der Gewebevorbehandlung unterscheiden sich je nachdem, wie die Proben vorbereitet werden.

1. Führen Sie für formaldehydfixierte, in Paraffin eingebettete (FFPE) klinische Proben die folgenden Schritte aus.
   1. Geben Sie die Proben in eine aufeinanderfolgende Reihe von Lösungen (ein Glasobjektträger-Färbegefäß oder ein konisches 50-ml-Röhrchen kann verwendet werden): Xylol, 95 % Ethanol, 70 % Ethanol und 50 % Ethanol, gefolgt von doppelt deionisiertem Wasser. Verwenden Sie jede Lösung zweimal für jeweils mindestens 3 Minuten. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Objektträger in den Behälter zu legen, und fügen Sie 15 ml der entsprechenden Lösung hinzu (genug, um die Probe zu bedecken). Legen Sie das verschlossene konische Röhrchen waagerecht auf einen Shaker bei Raumtemperatur.
2. Für Proben, die gefärbt und auf permanente Objektträger montiert wurden, führen Sie die folgenden Schritte aus.
   1. Legen Sie den Objektträger kurz in Xylol und entfernen Sie die Deckgläser vorsichtig mit einem geeigneten Werkzeug, z. B. einer Rasierklinge. Wenn das Deckglas immer noch festsitzt, legen Sie die Objektträger in Xylol wieder auf Raumtemperatur, bis sich das Deckglas löst.
   2. Verarbeiten Sie dann die Proben als FFPE-Proben (Schritt 2.1.1).
      HINWEIS: Bei Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-gefärbten Objektträgern geht die Hämatoxylin- und Eosinfärbung während des Expansionsprozesses verloren.
3. Bei nicht fixierten gefrorenen Gewebeobjektträgern in OCT-Lösung (Optimum Cutting Temperature) fixieren Sie das Gewebe 10 Minuten lang bei −20 °C in Aceton, bevor Sie die Proben dreimal für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 1x PBS-Lösung waschen.
4. Bei zuvor fixierten gefrorenen klinischen Gewebeobjektträgern wird das OCT geschmolzen, indem die Objektträger 2 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert werden, und dann dreimal mit 1x PBS-Lösung für jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen.

3. Gewebepräparation für Paraformaldehyd-fixiertes Mäusegehirn

1. Befolgen Sie dieses Protokoll für Mäusehirnschnitte, die 30-50 μm dick sind.
   ANMERKUNG: Erfolg kann bei größeren Querschnitten erzielt werden, aber es können längere Zeiten für die Diffusion und Homogenisierung der Monomerlösung erforderlich sein.
2. Wenn die Abschnitte derzeit nicht in einer 1x PBS-Lösung gelagert werden (z. B. in einer 30%igen [v/v]-Glycerin- und 30%igen [v/v]-Ethylenglykollösung in 1x PBS), waschen Sie sie dreimal für jeweils mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur in 1x PBS in einer 6- bis 24-Well-Platte.
3. Besorgen Sie sich einen unbeschichteten Objektträger aus Glas. Wenn eine Seite des Objektträgers beschichtet ist, prüfen Sie mit einem nassen Pinsel, ob die beschichtete Seite unbeschichtet ist (oft besteht das Etikett der beschichteten Seite aus geschliffenem Glas und wird bei Nässe weniger undurchsichtig).
4. Verwenden Sie einen Pinsel, um das unbeschichtete Objektträger zu befeuchten. Entfernen Sie das Hirngewebe der Maus mit dem Pinsel von der Well-Platte und legen Sie es vorsichtig auf den Objektträger, indem Sie eine rollende Bewegung ausführen, um sicherzustellen, dass das Gewebe flach ist. Lassen Sie überschüssiges PBS auf dem Gewebe verbleiben, bis alle Abschnitte befestigt sind.
   HINWEIS: Ein einzelner Objektträger kann zwar für mehrere Gewebeschnitte verwendet werden, aber wenn mehrere Gewebeschnitte gleichzeitig geliert werden (auch auf separaten Objektträgern), muss mehr darauf geachtet werden, dass sie nicht vollständig austrocknen.
5. Entfernen Sie mit einem Laborpapiertuch den größten Teil des überschüssigen PBS vom Objektträger. Lassen Sie einen kleinen Flüssigkeitsring um jeden Gewebeabschnitt liegen, aber lassen Sie den Rest des Objektträgers weitgehend trocken. Diese verbleibende Flüssigkeit bedeckt das Gewebe, während die Gelmonomerlösung hergestellt wird.

4. Gelieren

HINWEIS: Dieses Protokoll ist für alle Gewebetypen geeignet, die für die Verwendung mit dieser Technik vorbereitet sind.

1. Bringen Sie Abstandshalter auf beiden Seiten des Gewebeabschnitts an (Abbildung 2A), um eine Kompression des Gewebes zu verhindern. Stellen Sie dazu die Abstandshalter her, indem Sie mit einem diamantbestückten Stift dünne Stücke des Deckglases schneiden und sie dann mit kleinen Mengen Wasser oder 1x PBS auf dem Objektträger befestigen oder mit einer kleinen Menge Sekundenkleber fixieren. Platzieren Sie als Nächstes vorsichtig die Abstandshalter auf beiden Seiten des Gewebes.
2. Bereiten Sie die endgültige Gelierlösung vor. Im Allgemeinen sind ~200 μl pro Gewebeschnitt ausreichend, aber das Volumen sollte 800 μl pro Objektträger nicht überschreiten. Jede weitere Gelierlösung führt zu einem Überlauf.
   HINWEIS: Methacrolein wird verwendet, um Biomoleküle im Gel zu verankern. Es ist jedoch kein separater Verankerungsschritt erforderlich, und Methacrolein kann direkt zur endgültigen Gelierlösung hinzugefügt werden.
   1. Kombinieren Sie pro Abschnitt in der Reihenfolge: 200 μl Monomerlösung, 0,5 μl 0,5%ige 4HT-Stammlösung (1:400-Verdünnung), 0,2-0,5 μl Methacrolein (1:400-1:1.000-Verdünnung je nach Gewebetyp; im Allgemeinen eine Verdünnung von 1:1.000 für paraformaldehyd [PFA]-fixierte Proben und 1:400 für klinische FFPE-Proben), 2 μl 10%ige TEMED-Stammlösung (1:100-Verdünnung), und 5 μl 10%ige A.P.S.-Stammlösung (1:40 Verdünnung).
      HINWEIS: Bereiten Sie die endgültige Gelierlösung unmittelbar vor der Anwendung vor. Um ein vorzeitiges Gelieren zu verhindern, fügen Sie die APS-Lösung zuletzt hinzu.
3. Entfernen Sie die überschüssige Lösung aus dem Gewebeabschnitt und legen Sie den Objektträger in eine Petrischale. Die gesamte frisch zubereitete, kalte Gelierlösung wird zur Probe gegeben und die Mischung 30 Minuten lang bei 4 °C auf das Gewebe inkubiert, damit sie in das Gewebe diffundieren kann.
4. Legen Sie einen zweiten unbeschichteten Objektträger vorsichtig über das Gewebe und die Gellösung. Luftblasen sollten vermieden werden (Abbildung 2B).
   HINWEIS: Wenn Luftblasen über dem Gewebe eingeschlossen werden, kann der Glasdeckel vorsichtig angehoben und wieder aufgesetzt werden. Darüber hinaus kann jede austretende Monomerlösung nach der Polymerisation abgeschnitten werden und verursacht keine Probleme für das Gewebe.
5. Stellen Sie sicher, dass die Polymerisation abgeschlossen ist. Diese Polymerisation kann auf zwei Arten erfolgen, die jeweils zu ähnlichen Ergebnissen führen. Zunächst werden die Proben bei 37 °C in einer befeuchteten Umgebung (z. B. einer geschlossenen Petrischale mit einem feuchten Papiertuch) über Nacht inkubiert. Alternativ können die Proben für eine schnellere Polymerisation 2 h bei 37 °C in der befeuchteten Atmosphäre und anschließend 1 h bei 60 °C inkubiert werden.

5. Probenaufschluss und Gewebeexpansion

HINWEIS: Dieses Protokoll ist für alle Gewebetypen geeignet.

1. Tragen Sie einen Augenschutz und schieben Sie eine Rasierklinge zwischen die beiden Glasobjektträger der Gelierkammer, um sie zu trennen.
   HINWEIS: Die Objektträger sollten sich sehr leicht trennen lassen. Wenn verschiedene Teile des Gels auf beide Objektträger geklebt sind, kann ein Pinsel verwendet werden, um das Gel zu dem einen oder anderen zu führen. Wenn das Gel während der Polymerisation besonders trocken geworden ist, kann 1x PBS auf die Außenseite der Gelkammer aufgetragen werden, aber tauchen Sie das Gel nicht vollständig ein, da es sich dadurch ausdehnt, bevor das Gewebe homogenisiert wird, was zu Rissen führt.
2. Schneiden Sie das leere Gel um das Gewebe herum, um das Volumen zu minimieren. Das asymmetrische Schneiden des Gels ermöglicht es, die Ausrichtung des Gels nach der Homogenisierung zu verfolgen, da die Probe vollständig transparent ist.
3. Heben Sie das gewebehaltige Gel vorsichtig mit einer Rasierklinge vom Objektträger ab und geben Sie es vorsichtig mit einem Pinsel in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen.
4. Füllen Sie das Röhrchen bis zum Rand mit auf 80 °C vorgewärmtem Homogenisierungspuffer (Tabelle 2).
5. Die Probe wird bei 80 °C für 8 h (PFA-fixiertes Mäusegehirn) bzw. 60 h (die meisten klinischen FFPE-Proben; siehe Tabelle 3) geschüttelt.
   HINWEIS: Die Homogenisierungszeit hängt vom Gewebetyp und der Fixierungsmethode ab. Viele dieser Bedingungen wurden bereits validiert, aber für andere kann eine Optimierung erforderlich sein.
6. Gießen Sie den Inhalt des Zentrifugenröhrchens in eine einzelne Vertiefung einer 6-Well-Zellkulturplatte aus Kunststoff.
7. Entfernen Sie den Denaturierungspuffer mit einer Transferpipette.
8. Um das verbleibende SDS vollständig aus dem Hydrogel zu entfernen, wird die Probe in einer 1%igen nichtionischen Tensidlösung (_C12E 10) wie folgt gewaschen: mindestens dreimal für jeweils₁₀ Minuten bei Raumtemperatur; 60 min bei 60 °C; und dann weitere drei Wäschen für jeweils 10 min bei Raumtemperatur.
9. Lagern Sie die Probe in 1x PBS + 0,02% Natriumazid bei 4 °C, bis eine Färbung und Bildgebung nach der Expansion durchgeführt werden muss.
   HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sollte die Probe in jeder Dimension ~3-4,5-fach größer sein, je nach Gewebetyp.

6. Profilierung von Biomolekülen nach der Expansion

1. Färbung von Antikörpern
   HINWEIS: Dies folgt einem typischen Immunfluoreszenz-/Immunhistochemie-Färbeprotokoll (I.H.C.). Die Menge der verwendeten Primär- und Sekundärantikörper hängt von den vom Hersteller vorgeschlagenen Konzentrationen oder von der Optimierung für das jeweilige Experiment ab. Einzelne Puffer können nach eigenem Ermessen ausgetauscht werden.
   1. Waschen Sie die expandierten Proben mit der Probe in einer einzigen Vertiefung einer 6-Well-Zellkulturplatte dreimal für jeweils 10 Minuten in 1x PBS bei R.T. und übertragen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette.
   2. Führen Sie einen optionalen Blockierungsschritt (z. B. 3 % Rinderserumalbumin/0,1 % Triton-X100 in 1x PBS) für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C durch.
   3. Inkubieren Sie mit den primären Antikörpern in Färbepuffer (z. B. 0,1 % Triton-X100 1x PBS oder 9 x PBS/1 % TritonX/10 mg/l Heparin) über Nacht bei 37 °C. Je nach Probengröße sollten 0,5-2 ml das Gel ausreichend abdecken.
   4. Waschen Sie die Probe dreimal für jeweils mindestens 10 min in 1x PBS bei Raumtemperatur.
   5. Die entsprechenden Sekundärantikörper werden für 3 h bei 37 °C im Färbepuffer der Wahl inkubiert.
   6. Waschen Sie die Probe dreimal für jeweils mindestens 10 min in 1x PBS bei Raumtemperatur.
2. NHS-Ester-Pan-Protein-Färbung
   1. Wenn sich die Probe in einer 6-Well-Platte befindet, gießen Sie 1-2 ml Polyethylenglykol (PEG 200) auf die Probe (genug, um sie vollständig zu bedecken).
      HINWEIS: Das Gewebe sollte schrumpfen und zu seiner ursprünglichen Größe vor der Vergrößerung zurückkehren (oder nahe daran).
   2. Färbung mit Fluorophor-konjugiertem NHS-Ester, verdünnt auf 13,3-80 μg/ml für 3 h bei R.T. in 1-2 ml Färbepuffer (z. B. 1x PBS, 2x S.S.C. oder 100 mM Natriumbicarbonatlösung).
   3. Waschen Sie die Probe dreimal für jeweils mindestens 10 min in 1x PBS bei Raumtemperatur.
3. Lipid-Färbung
   HINWEIS: Die Lipidfärbung nach der Expansion ist bei klinischen FFPE-Proben nicht wirksam, da Lipide während des Fixierungsprozesses verloren gehen.
   1. Waschen Sie die Probe dreimal für jeweils mindestens 10 min in 1x PBS bei Raumtemperatur.
   2. Tragen Sie einen herkömmlichen lipophilen Farbstoff (DiO, DiI oder DiD) auf, der 200-fach verdünnt in 2 ml 0,1% TritonX-100/1x PBS für 72-96 h bei Raumtemperatur ist.
   3. Mindestens dreimal mit 1x PBS waschen
4. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
   1. Homogenisierte Gelproben werden 30 min lang in einen auf 60 °C vorgewärmten Hybridisierungspuffer gegeben.
   2. Bereiten Sie den Hybridisierungspuffer für FISH vor: Kombinieren Sie 2x S.S.C. (300 mM NaCl, 30 mM Natriumcitrat, pH 7,0), 10 % (v/v) Dextransulfat, 20 % (v/v) Ethylencarbonat und 0,1 % (v/v) Tween20.
   3. Inkubieren Sie die Gelproben mit einem Hybridisierungspuffer, der 10 pM (pro Oligo) FISH-Sonden gegen das Zielgen (mindestens 20 Sonden pro 10 kb) bei 45 °C über Nacht enthält.
   4. Mit Stringency Wash Buffer (2x S.S.C. und 0,1% Tween20) zweimal für jeweils 15 min bei 45 °C waschen.
   5. Mit Stringency Wash Buffer weitere zwei Male für jeweils 10 min bei 37 °C waschen.
   6. Zum Schluss mit 1x PBS mindestens dreimal für jeweils 10 min bei Raumtemperatur waschen.
   7. Die Proben sind bereit für die Bildgebung oder Lagerung in 1x PBS + 0,02% Natriumazid bei 4 °C.
5. Vollständige Gewebeexpansion und Fluoreszenzbildgebung
   HINWEIS: Der mit Magnify erreichbare Expansionsfaktor variiert je nach Gewebetyp und Expansionsmethode (eine vollständige Zusammenfassung finden Sie in Tabelle 3). Als allgemeine Schätzung wird sich eine vergrößerte Probe jedoch um das 3- bis 4,5-fache in 1x PBS, um das 5- bis 7-fache in PBS, verdünnt auf 1:50 in ddH2O_,und um das 8- bis 11-fache in ddH2O ausdehnen. Der optimale Expansionsfaktor für die Bildgebung hängt von den Anforderungen des jeweiligen Experiments ab. Der Expansionsfaktor ist hochgradig abstimmbar, so dass eine einzelne Probe für die Bildgebung auf verschiedenen Skalen um ein Vielfaches erweitert und verkleinert werden kann.
   1. Verschieben Sie die in PBS 4-fach expandierten Proben mit einem Pinsel auf eine 6-Well-Speicherfolie mit Glasboden. Bewegen Sie jede Probe weiter expandiert, indem Sie sie in kleinere Stücke schneiden oder vorsichtig in eine große Glasboden-Speicherfolie mit einem dünnen Stück flexiblem Kunststoff legen.
   2. Führen Sie die Fluoreszenzbildgebung mit einem herkömmlichen Weitfeldmikroskop, einem konfokalen Mikroskop oder einem anderen Bildgebungssystem Ihrer Wahl durch. Das Entfernen überschüssiger Flüssigkeit um das Gel herum mit einem Labortuch aus Papier kann die Bewegung des Gels während der Bildgebung verhindern. Die Gele können auch immobilisiert werden, indem 0,1 % Poly-L-Lysin vor der Bildgebung auf die Glasoberfläche aufgetragen werden.
      HINWEIS: Die Anwendung von Poly-L-Lysin macht das Gel bei Kontakt völlig unbeweglich. Aus diesem Grund muss darauf geachtet werden, dass das Gel ohne Falten oder Dehnen auf das Glas aufgetragen wird. Darüber hinaus sollte das Gel auf Poly-L-Lysin-beschichtetem Glas nicht vollständig trocknen, da dies die Entfernung erschweren könnte, und das Gel sollte nicht in PBS geschrumpft werden, während es noch mit Poly-L-Lysin am Glas befestigt ist, da dies zu Gel- oder Gewebeschäden führen könnte.
   3. Nach der Bildgebung schrumpfen die Proben in 1x PBS mit mindestens drei Wäschen für jeweils 10 min, da es aufgrund der Degradation des Fluoreszenzsignals nicht empfohlen wird, die Proben langfristig in_ddH2Ozu lagern. Insbesondere vollständig expandierte Proben, die mit lipophilen Farbstoffen gefärbt wurden, sollten so nah wie möglich am Zeitpunkt der Expansion abgebildet werden, um eine Dissoziation des Farbstoffs in Wasser zu verhindern.
   4. Lagern Sie die Proben in 1x PBS + 0,02% Natriumazid bei 4 °C.

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Ergebnisse

Wenn das Protokoll erfolgreich abgeschlossen wurde (Abbildung 1), erscheint die Probe nach der Hitzedenaturierung klar und flach. Jede Faltung oder Faltenbildung deutet auf eine unvollständige Homogenisierung hin. Eine erfolgreich expandierte Probe ist 3-4,5-mal größer als vor der Expansion in 1x PBS und 8-11-mal größer, wenn sie vollständig in ddH_2Oexpandiert ist. Abbildung 3 zeigt Beispiele für Pre- und Post-Expansionsbilder einer 5 μm dicke...

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Diskussion

Hier stellen wir das Magnify-Protokoll¹⁷ vor, eine ExM-Variante, die mehrere Biomoleküle mit einem einzigen chemischen Anker zurückhalten und anspruchsvolle klinische FFPE-Proben durch Hitzedenaturierung bis zu 11-fach erweitern kann. Zu den wichtigsten Änderungen in diesem Protokoll, die es von anderen ExM-Protokollen unterscheiden, gehören die Verwendung eines neu formulierten Gels, das auch bei vollständiger Expansion mechanisch robust bleibt, sowie die Verwendung von Methacrolein als Biom...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)	Cellvis	P06-1.5H-N
Acrylamide	Sigma Aldrich	A8887	Gel Monomer component
Ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiatior
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10)	Sigma Aldrich	P9769	Non-ionic surfactant
Diamond knife No. 88 CM	General Tools	31116
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M	VWR	BDH7830-1	Homogenization Buffer Component
Forceps
Glycine	Sigma Aldrich	G8898	Homogenization Buffer Component
Heparin	Sigma Aldrich	H3393
Methacrolein	Sigma Aldrich	133035	Anchoring Agent
Micro cover Glass #1 (24x60mm)	VWR	48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis)	Sigma Aldrich	M7279	Gel Monomer component
N,N-dimethylacrylamide (DMAA)	Sigma Aldrich	274135	Gel Monomer component
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish	Thermo Fisher	167063
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish	Thermo Fisher	140675
Nunc™ 15mL Conical	Thermo Fisher	339651
Nunc™ 50mL Conical	Thermo Fisher	339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution	Fischer Scientific	BP399-1
Polyethylene glycol  200	Sigma Aldrich	P-3015
Proteinase K (Molecular Biology Grade)	Thermo Scientific	EO0491
Razor blade	Fischer Scientifc	12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
Sodium acrylate (SA)	AK Scientific	R624	Gel Monomer component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L3771	Homogenization Buffer Component
Tris Base	Fischer Scientific	BP152-1	Homogenization Buffer Component
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Urea	Sigma Aldrich	U5378	Homogenization Buffer Component
Xylenes	Sigma Aldrich	214736
20x SSC	Thermo Scientific	AM9763
Tween20	Sigma Aldrich	P1379
poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P8920