11倍膨張顕微鏡によるユニバーサル分子保持

要約

ここでは、最大11倍の拡張に変更された拡張顕微鏡(ExM)の新しいバージョンであるMagnifyは、生体分子クラスの包括的な配列を保存し、幅広い組織タイプと互換性があります。これにより、従来の回折限界顕微鏡を使用して生体分子のナノスケール構造を調べることができます。

要約

生体試料のナノスケールイメージングは、疾患の病因の理解を深めることができます。近年、膨張顕微鏡(ExM)は、光学超解像顕微鏡法に代わる効果的で低コストの代替手段であることが実証されています。しかし、ゲル内で異なる生体分子クラスを保持するための特異的でしばしばカスタムのアンカー剤の必要性、および特により大きな拡張因子または保存されたタンパク質エピトープが望まれる場合、ホルマリン固定パラフィン包埋組織などの標準的な臨床サンプルフォーマットを拡張することの難しさによって制限されてきました。ここでは、幅広い組織タイプで最大11倍の堅牢な拡張を実現する新しいExMメソッドであるMagnifyについて説明します。組織とゲルの間の化学アンカーとしてメタクロレインを使用することにより、Magnifyはタンパク質、脂質、核酸などの複数の生体分子をゲル内に保持し、従来の光学顕微鏡で組織の広範なナノスケールイメージングを可能にします。このプロトコルでは、堅牢で亀裂のない組織拡張を確保するためのベストプラクティスと、高度に拡張されたゲルの取り扱いとイメージングのヒントについて説明します。

概要

生物学的システムは、手足や臓器からナノスケールのタンパク質レベルまで、構造的な不均一性を示します。したがって、これらのシステムの動作を完全に理解するには、これらのサイズスケール全体で目視検査が必要です。しかし、光の回折限界は、従来の蛍光顕微鏡で~200-300nmより小さい構造を可視化する際に課題を引き起こす。さらに、誘導放出空乏法(STED)、光活性化局在顕微鏡(PALM)、確率的光学再構成顕微鏡(STORM)、構造化照明顕微鏡法(SIM)などの光学超解像法^1,2,3は強力ですが、高価なハードウェアと試薬を必要とし、取得時間が遅く、大量の画像を3Dで画像化する能力が低いことが多いため、独自の課題があります。

膨張顕微鏡⁴(ExM)は、生体分子を水膨潤性ポリマーゲルに共有結合で固定し、物理的に引き離して従来の光学顕微鏡で分解できるようにすることで、光の回折限界を回避する代替手段を提供します。10年足らず前にExMが最初に発表されて以来、多数のExMプロトコルバリアントが開発されており、これらのプロトコルにより、タンパク質⁵、⁶、

プロトコル

動物を含むすべての実験手順は、国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに従って実施され、カーネギーメロン大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。ヒト組織サンプルを商業的に入手した。

1.ストック試薬および溶液の調製

注:使用する試薬のリストについては、 材料表 を参照してください。

1. ゲル化原液を調製します。これらは、ゲル化工程の直前に組み合わされる。
   1. モノマーストック溶液(4 g / 100 mL N,N-ジメチルアクリルアミド酸[DMAA]、50 g / 100 mLアクリル酸ナトリウム[SA]、66.7 g / 100 mLアクリルアミド[AA]、0.10 g / 100 mL N、N'-メチレンビスアクリルアミド[ビス]、33 g / 100 mL塩化ナトリウム[NaCl]、1xリン酸緩衝生理食塩水;PBS)を 表1に列挙した成分を用いた。すべての原液を水に溶解または希釈します。モノマーストック溶液は、4°Cで少なくとも3ヶ月間保存することができる。
   2. 以下のストック溶液を水中で別々に調製する:0.5%(w/w)4-ヒドロキシ-TEMPO(4HT)は組織へのモノマー拡散中のゲル化を阻害し、10%(w/w)テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)....

ディスカッション

ここでは、単一の化学的アンカーで複数の生体分子を保持し、熱変性により困難なFFPE臨床検体を最大11倍まで拡張できるExMバリアントであるMagnifyプロトコル¹⁷を紹介します。このプロトコルを他のExMプロトコルと区別する主な変更点には、完全に拡張しても機械的に堅牢なままである再製剤化ゲルの使用、および生体分子アンカーとしてのメタクロレインの使用が含まれま?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)	Cellvis	P06-1.5H-N
Acrylamide	Sigma Aldrich	A8887	Gel Monomer component
Ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiatior
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10)	Sigma Aldrich	P9769	Non-ionic surfactant
Diamond knife No. 88 CM	General Tools	31116
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M	VWR	BDH7830-1	Homogenization Buffer Component
Forceps
Glycine	Sigma Aldrich	G8898	Homogenization Buffer Component
Heparin	Sigma Aldrich	H3393
Methacrolein	Sigma Aldrich	133035	Anchoring Agent
Micro cover Glass #1 (24x60mm)	VWR	48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis)	Sigma Aldrich	M7279	Gel Monomer component
N,N-dimethylacrylamide (DMAA)	Sigma Aldrich	274135	Gel Monomer component
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish	Thermo Fisher	167063
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish	Thermo Fisher	140675
Nunc™ 15mL Conical	Thermo Fisher	339651
Nunc™ 50mL Conical	Thermo Fisher	339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution	Fischer Scientific	BP399-1
Polyethylene glycol  200	Sigma Aldrich	P-3015
Proteinase K (Molecular Biology Grade)	Thermo Scientific	EO0491
Razor blade	Fischer Scientifc	12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
Sodium acrylate (SA)	AK Scientific	R624	Gel Monomer component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L3771	Homogenization Buffer Component
Tris Base	Fischer Scientific	BP152-1	Homogenization Buffer Component
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Urea	Sigma Aldrich	U5378	Homogenization Buffer Component
Xylenes	Sigma Aldrich	214736
20x SSC	Thermo Scientific	AM9763
Tween20	Sigma Aldrich	P1379
poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P8920