Ritenzione molecolare universale con microscopia ad espansione 11 volte

Riepilogo

Presentata qui è una nuova versione della microscopia ad espansione (ExM), Magnify, che viene modificata per un'espansione fino a 11 volte, conservando una gamma completa di classi di biomolecole ed è compatibile con una vasta gamma di tipi di tessuto. Consente l'interrogazione della configurazione su scala nanometrica delle biomolecole utilizzando microscopi convenzionali limitati alla diffrazione.

Abstract

L'imaging su scala nanometrica di campioni biologici può migliorare la comprensione della patogenesi della malattia. Negli ultimi anni, la microscopia ad espansione (ExM) ha dimostrato di essere un'alternativa efficace e a basso costo alla microscopia ottica a super-risoluzione. Tuttavia, è stato limitato dalla necessità di agenti di ancoraggio specifici e spesso personalizzati per mantenere diverse classi di biomolecole all'interno del gel e dalle difficoltà nell'espandere i formati di campioni clinici standard, come il tessuto incorporato in paraffina fissato in formalina, specialmente se si desiderano fattori di espansione più grandi o epitopi proteici conservati. Qui descriviamo Magnify, un nuovo metodo ExM per un'espansione robusta fino a 11 volte in una vasta gamma di tipi di tessuto. Utilizzando la metacroleina come ancoraggio chimico tra il tessuto e il gel, Magnify trattiene più biomolecole, come proteine, lipidi e acidi nucleici, all'interno del gel, consentendo così l'imaging su larga scala dei tessuti sui microscopi ottici convenzionali. Questo protocollo descrive le migliori pratiche per garantire un'espansione dei tessuti robusta e priva di crepe, nonché suggerimenti per la manipolazione e l'imaging di gel altamente espansi.

Introduzione

I sistemi biologici mostrano eterogeneità strutturale, dagli arti e dagli organi fino ai livelli di proteine su scala nanometrica. Pertanto, una comprensione completa del funzionamento di questi sistemi richiede un esame visivo su queste scale dimensionali. Tuttavia, il limite di diffrazione della luce causa difficoltà nella visualizzazione di strutture più piccole di ~ 200-300 nm su un microscopio a fluorescenza convenzionale. Inoltre, i metodi ottici di super-risoluzione ^1,2,3, come la deplezione di emissione stimolata (STED), la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM), la microscopia a ricostruzione ottica stocastica (ST....

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono gli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del National Institutes of Health (NIH) e sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Carnegie Mellon University. Sono stati ottenuti commercialmente campioni di tessuto umano.

1. Preparazione dei reagenti e delle soluzioni stock

NOTA: Fare riferimento alla Tabella dei Materiali per un elenco dei reagenti utilizzati.

1. Preparare le soluzioni di gelificante. Questi saranno combinati immediatamente prima della fase di gelificazione....

Discussione

Qui, presentiamo il protocollo Magnify 17, una variante ExM che può trattenere più biomolecole con un singolo ancoraggio chimico ed espandere campioni clinici FFPE impegnativi fino a¹¹ volte con denaturazione termica. I cambiamenti chiave in questo protocollo che lo distinguono da altri protocolli ExM includono l'uso di un gel riformulato che rimane meccanicamente robusto anche quando completamente espanso, così come l'uso di metacroleina come ancoraggio della biomolecola. I passaggi più criti.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)	Cellvis	P06-1.5H-N
Acrylamide	Sigma Aldrich	A8887	Gel Monomer component
Ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiatior
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10)	Sigma Aldrich	P9769	Non-ionic surfactant
Diamond knife No. 88 CM	General Tools	31116
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M	VWR	BDH7830-1	Homogenization Buffer Component
Forceps
Glycine	Sigma Aldrich	G8898	Homogenization Buffer Component
Heparin	Sigma Aldrich	H3393
Methacrolein	Sigma Aldrich	133035	Anchoring Agent
Micro cover Glass #1 (24x60mm)	VWR	48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis)	Sigma Aldrich	M7279	Gel Monomer component
N,N-dimethylacrylamide (DMAA)	Sigma Aldrich	274135	Gel Monomer component
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish	Thermo Fisher	167063
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish	Thermo Fisher	140675
Nunc™ 15mL Conical	Thermo Fisher	339651
Nunc™ 50mL Conical	Thermo Fisher	339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution	Fischer Scientific	BP399-1
Polyethylene glycol  200	Sigma Aldrich	P-3015
Proteinase K (Molecular Biology Grade)	Thermo Scientific	EO0491
Razor blade	Fischer Scientifc	12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
Sodium acrylate (SA)	AK Scientific	R624	Gel Monomer component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L3771	Homogenization Buffer Component
Tris Base	Fischer Scientific	BP152-1	Homogenization Buffer Component
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Urea	Sigma Aldrich	U5378	Homogenization Buffer Component
Xylenes	Sigma Aldrich	214736
20x SSC	Thermo Scientific	AM9763
Tween20	Sigma Aldrich	P1379
poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P8920