采用 11 倍扩增显微镜的通用分子保留

摘要

这里展示的是新版本的扩增显微镜（ExM），放大，经过修改可扩展高达11倍，保留全面的生物分子类别，并与多种组织类型兼容。它能够使用传统的衍射极限显微镜询问生物分子的纳米级构型。

摘要

生物标本的纳米级成像可以提高对疾病发病机制的认识。近年来，扩展显微镜（ExM）已被证明是光学超分辨率显微镜的有效且低成本的替代方案。然而，由于需要特定的且通常是定制的锚定剂来保留凝胶内不同的生物分子类别，以及难以扩展标准临床样品形式（例如福尔马林固定石蜡包埋的组织），特别是如果需要更大的扩增因子或保留的蛋白质表位，它受到了限制。在这里，我们描述了Magnify，这是一种新的ExM方法，可在各种组织类型中实现高达11倍的稳健扩增。通过使用甲基丙烯醛作为组织和凝胶之间的化学锚，Magnify在凝胶中保留了多种生物分子，例如蛋白质，脂质和核酸，从而允许在传统光学显微镜上对组织进行广泛的纳米级成像。该协议描述了确保稳定和无裂纹组织扩增的最佳实践，以及处理和成像高度扩增凝胶的技巧。

引言

生物系统表现出结构异质性，从四肢和器官到纳米级的蛋白质水平。因此，要全面了解这些系统的运行情况，需要对这些尺寸尺度进行目视检查。然而，光的衍射极限给在传统荧光显微镜上可视化小于~200-300nm的结构带来了挑战。此外^，光学超分辨率方法^1,2,3，如受激发射损耗（STED），光激活定位显微镜（PALM），随机光学重建显微镜（STORM）和结构照明显微镜（SIM），虽然功能强大，但也带来了自己的挑战，因为它们需要昂贵的硬件和试剂，并且通常采集时间慢，并且在3D中成像大体积的能力差。

膨胀显微镜⁴（ExM）提供了一种规避光衍射极限的替代方法，方法是将生物分子共价锚定到可水溶胀的聚合物凝胶中并将它们物理拉开，从而使它们在传统光学显微镜上可分辨。自不到十年前ExM首次发表以来，已经开发了多种ExM方案变体，这些方案允许直接掺入蛋白质5,6,7，RNA 8,9,10或脂质^11,12,13

研究方案

所有涉及动物的实验程序均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南进行，并得到卡内基梅隆大学机构动物护理和使用委员会的批准。人体组织样本是商业获得的。

1. 储备试剂和溶液的制备

注意：有关所用试剂的列表，请参阅 材料表 。

1. 准备胶凝储备液。这些将在胶凝步骤之前立即组合。
   1. 制备单体储备溶液（4 g/100 mL N，N-二甲基丙烯酰胺酸 [DMAA]、50 g/100 mL 丙烯酸钠 [SA]、66.7 g/100 mL 丙烯酰胺 [AA]、0.10 g/100 mL N，N′-亚甲基双丙烯酰胺 [Bis]、33 g/100 mL 氯化钠 [NaCl]、1x 磷酸盐缓冲盐水;PBS），使用 表 1 中列出的组件。将所有储备溶液溶解或稀释在水中。单体储备溶液可在4°C下储存至少3个月。
   2. 在水中分别制备以下储备溶液：0.5%（w / w）4-羟基-TEMPO （4HT），在单体扩散到组织中期间抑制凝胶化，以及10%（w / w）四甲基乙二胺（TEMED），其加速过硫酸铵（APS）引发的自由基生成，并以10%（w / w）制备。
      注意：储备溶液可以分成1-2mL等分试样，并在4°C下储存长达3个月;但是，APS是在制备胶凝溶液之前立即进行的。

讨论

在这里，我们介绍了放大方案17，这是一种ExM变体，可以用单个化学锚保留多个生物分子，并通过热变性将具有挑战性的FFPE临床标本扩展至¹¹倍。该方案区别于其他ExM方案的关键变化包括使用重新配制的凝胶，即使在完全扩增时也能保持机械坚固性，以及使用甲基丙烯醛作为生物分子锚。该方案中最关键的步骤如下：1）最终凝胶溶液的组成;2）凝胶化步骤的时间;3）凝胶室的设置.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)	Cellvis	P06-1.5H-N
Acrylamide	Sigma Aldrich	A8887	Gel Monomer component
Ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiatior
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10)	Sigma Aldrich	P9769	Non-ionic surfactant
Diamond knife No. 88 CM	General Tools	31116
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M	VWR	BDH7830-1	Homogenization Buffer Component
Forceps
Glycine	Sigma Aldrich	G8898	Homogenization Buffer Component
Heparin	Sigma Aldrich	H3393
Methacrolein	Sigma Aldrich	133035	Anchoring Agent
Micro cover Glass #1 (24x60mm)	VWR	48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis)	Sigma Aldrich	M7279	Gel Monomer component
N,N-dimethylacrylamide (DMAA)	Sigma Aldrich	274135	Gel Monomer component
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish	Thermo Fisher	167063
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish	Thermo Fisher	140675
Nunc™ 15mL Conical	Thermo Fisher	339651
Nunc™ 50mL Conical	Thermo Fisher	339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution	Fischer Scientific	BP399-1
Polyethylene glycol  200	Sigma Aldrich	P-3015
Proteinase K (Molecular Biology Grade)	Thermo Scientific	EO0491
Razor blade	Fischer Scientifc	12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
Sodium acrylate (SA)	AK Scientific	R624	Gel Monomer component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L3771	Homogenization Buffer Component
Tris Base	Fischer Scientific	BP152-1	Homogenization Buffer Component
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Urea	Sigma Aldrich	U5378	Homogenization Buffer Component
Xylenes	Sigma Aldrich	214736
20x SSC	Thermo Scientific	AM9763
Tween20	Sigma Aldrich	P1379
poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P8920