Rétention moléculaire universelle avec microscopie à expansion 11 fois

Résumé

Une nouvelle version de la microscopie à expansion (ExM), Magnify, modifiée pour une expansion allant jusqu’à 11 fois, conservant une gamme complète de classes de biomolécules et compatible avec un large éventail de types de tissus. Il permet d’interroger la configuration nanométrique de biomolécules à l’aide de microscopes conventionnels à diffraction limitée.

Résumé

L’imagerie à l’échelle nanométrique de spécimens biologiques peut améliorer la compréhension de la pathogenèse de la maladie. Au cours des dernières années, la microscopie à expansion (ExM) s’est avérée être une alternative efficace et peu coûteuse à la microscopie optique à superrésolution. Cependant, il a été limité par le besoin d’agents d’ancrage spécifiques et souvent personnalisés pour conserver différentes classes de biomolécules dans le gel et par les difficultés liées à l’expansion des formats d’échantillons cliniques standard, tels que les tissus incorporés dans la paraffine fixés au formol, en particulier si des facteurs d’expansion plus importants ou des épitopes de protéines préservés sont souhaités. Ici, nous décrivons Magnify, une nouvelle méthode ExM pour une expansion robuste jusqu’à 11 fois dans un large éventail de types de tissus. En utilisant la méthacroléine comme ancrage chimique entre le tissu et le gel, Magnify retient plusieurs biomolécules, telles que des protéines, des lipides et des acides nucléiques, dans le gel, permettant ainsi l’imagerie à grande échelle nanométrique des tissus sur des microscopes optiques conventionnels. Ce protocole décrit les meilleures pratiques pour assurer une expansion tissulaire robuste et sans fissures, ainsi que des conseils pour la manipulation et l’imagerie des gels hautement expansés.

Introduction

Les systèmes biologiques présentent une hétérogénéité structurelle, des membres et des organes jusqu’aux niveaux de protéines à l’échelle nanométrique. Par conséquent, une compréhension complète du fonctionnement de ces systèmes nécessite un examen visuel à travers ces échelles de taille. Cependant, la limite de diffraction de la lumière pose des problèmes de visualisation de structures inférieures à ~200-300 nm sur un microscope à fluorescence conventionnel. En outre, les méthodes optiques de super-résolution ^1,2,3, telles que la déplétion par émission stimulée (STED), la microscopie de localisation photoactivée (PALM), la microscop....

Protocole

Toutes les procédures expérimentales impliquant des animaux ont été menées conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH) et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Carnegie Mellon. Des échantillons de tissus humains ont été obtenus commercialement.

1. Préparation des réactifs et solutions mères

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour obtenir la liste des réactifs utilisés.

1. Préparer les solutions de gélifiant. Ceux-ci seront combinés immédiatement avant l’étape de gélification.<....

Discussion

Ici, nous présentons le protocole^{Magnify 17}, une variante ExM qui peut retenir plusieurs biomolécules avec une seule ancre chimique et multiplier par 11 les échantillons cliniques FFPE difficiles grâce à la dénaturation thermique. Les principaux changements apportés à ce protocole qui le distinguent des autres protocoles ExM comprennent l’utilisation d’un gel reformulé qui reste mécaniquement robuste même lorsqu’il est complètement expansé, ainsi que l’utilisation de méthacro.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)	Cellvis	P06-1.5H-N
Acrylamide	Sigma Aldrich	A8887	Gel Monomer component
Ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiatior
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10)	Sigma Aldrich	P9769	Non-ionic surfactant
Diamond knife No. 88 CM	General Tools	31116
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M	VWR	BDH7830-1	Homogenization Buffer Component
Forceps
Glycine	Sigma Aldrich	G8898	Homogenization Buffer Component
Heparin	Sigma Aldrich	H3393
Methacrolein	Sigma Aldrich	133035	Anchoring Agent
Micro cover Glass #1 (24x60mm)	VWR	48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis)	Sigma Aldrich	M7279	Gel Monomer component
N,N-dimethylacrylamide (DMAA)	Sigma Aldrich	274135	Gel Monomer component
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish	Thermo Fisher	167063
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish	Thermo Fisher	140675
Nunc™ 15mL Conical	Thermo Fisher	339651
Nunc™ 50mL Conical	Thermo Fisher	339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution	Fischer Scientific	BP399-1
Polyethylene glycol  200	Sigma Aldrich	P-3015
Proteinase K (Molecular Biology Grade)	Thermo Scientific	EO0491
Razor blade	Fischer Scientifc	12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
Sodium acrylate (SA)	AK Scientific	R624	Gel Monomer component
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L3771	Homogenization Buffer Component
Tris Base	Fischer Scientific	BP152-1	Homogenization Buffer Component
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Urea	Sigma Aldrich	U5378	Homogenization Buffer Component
Xylenes	Sigma Aldrich	214736
20x SSC	Thermo Scientific	AM9763
Tween20	Sigma Aldrich	P1379
poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P8920