A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) هي مجسات كيميائية مفيدة لتحديد وتوصيف هياكل G-quadruplex في قوالب الحمض النووي في المختبر. يفصل هذا البروتوكول الإجراء الخاص بإجراء تفاعلات التحقيق مع B-CePs وحل منتجات التفاعل عن طريق الرحلان الكهربائي عالي الدقة لهلام بولي أكريلاميد عالي الدقة.

Abstract

G-quadruplexes (G4s) هي هياكل الحمض النووي غير المتعارف عليها بيولوجيا والتي تلعب دورا مهما في التعبير الجيني والأمراض ، وتمثل أهدافا علاجية مهمة. هناك حاجة إلى طرق يمكن الوصول إليها لتوصيف الحمض النووي في المختبر ضمن تسلسلات تشكيل G-quadruplex المحتملة (PQSs). B-CePs هي فئة من عوامل الألكلة التي أثبتت أنها مجسات كيميائية مفيدة للتحقيق في البنية ذات الترتيب الأعلى للأحماض النووية. تصف هذه الورقة مقايسة رسم خرائط كيميائية جديدة تستغل التفاعل النوعي ل B-CePs مع N7 من الجوانين ، متبوعا بالانقسام المباشر في Gs الألكيلية.

وبالتحديد ، لتمييز طيات G4 عن أشكال الحمض النووي غير المطوية ، نستخدم B-CeP 1 لفحص أبتامير المرتبط بالثرومبين (TBA) ، وهو حمض نووي 15 مير قادر على تحمل ترتيب G4. ينتج عن تفاعل الجوانين المستجيب ل B-CeP مع B-CeP 1 منتجات يمكن حلها عن طريق الرحلان الكهربائي عالي الدقة لهلام بولي أكريلاميد (PAGE) على مستوى نيوكليوتيد واحد عن طريق تحديد موقع مقرب الألكلة الفردي وانقسام حبلا الحمض النووي في الجوانين الألكيل. يعد رسم الخرائط باستخدام B-CePs أداة بسيطة وقوية للتوصيف المختبري لتسلسلات الحمض النووي المكونة ل G-quadruplex ، مما يتيح تحديد الموقع الدقيق للجوانين المشاركة في تكوين G-tetrads.

Introduction

بالإضافة إلى الحلزون المزدوج النموذجي Watson-Crick ، يمكن للأحماض النووية اعتماد هياكل ثانوية مختلفة ، مثل الشكل البديل G-quadruplex (G4) ، بسبب تسلسلاتها الغنية بالجوانين. يعتمد هيكل G4 على تكوين رباعيات مستوية ، تسمى G-tetrades ، حيث تتفاعل أربعة جوانين من خلال روابط هيدروجينية Hoogsteen. يتم تكديس G-tetrads وتثبيتها بشكل أكبر بواسطة الكاتيونات أحادية التكافؤ التي يتم تنسيقها في وسط قلب الجوانين (الشكل 1)1.

figure-introduction-563

Protocol

1. إعداد الحمض النووي والمسبار الكيميائي

  1. الأحماض النووية
    ملاحظة: قليل النوكليوتيد المسمى "TBA" هو تسلسل الحمض النووي 15-mer 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3' المسمى في النهاية 3'بواسطة الفلوروفور 5-كربوكسي فلوريسئين (FAM) لتمكين التصور على الهلام. قليل النوكليوتيد غير المسمى "cTBA" هو تسلسل الحمض النووي التكميلي 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. يتم استخدام TBA و cTBA للحصول على الهياكل الثلاثة المختلفة ، كما هو موضح في الجدول 1.
    1. نصائح الأوتوكلاف وأنابيب 0.5 مل من أجل الحصول على المستهلكات المعقمة وتجنب التلوث.
    2. تحضير محاليل المخزون لإذابة كل قليل النوكليوتيد في ماء عالي النقاء إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ميكرومتر. حدد ترك....

النتائج

يوضح الشكل 2 نتيجة تمثيلية لمقايسة رسم الخرائط الكيميائية التي تم إجراؤها ، كما هو موضح في البروتوكول مع B-CeP 1 على قليل النوكليوتيد TBA المطوي في ثلاثة هياكل مختلفة. تم الحصول على ترتيب G-quadruplex ل TBA (G4-TBA) عن طريق طي قليل النوكليوتيد في BPE وفي وجود الكاتيون K + ، في حين تم طي ا?.......

Discussion

G-quadruplexes هي هياكل ثانوية للحمض النووي تطوى عادة داخل تسلسل الحمض النووي الغني بالجوانين ، وهي أهداف بحثية مهمة بسبب ارتباطها بالتحكم الجيني والأمراض. يعد رسم الخرائط الكيميائية بواسطة B-CePs بروتوكولا مفيدا لتوصيف الحمض النووي G4s ، والذي يمكن استخدامه لتحديد قواعد الجوانين المشاركة في تكوي?.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل قسم العلوم الصيدلانية والدوائية ، جامعة بادوفا (PRIDJ-BIRD2019).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acrylamide/bis-acrylamide solution 40%ApplichemA3658R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/
24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS)Sigma AldrichA7460
Analytical balanceMettler Toledo
Autoclavepbi international
Boric acidSigma AldrichB0252
Bromophenol blue Brilliant blue RSigma AldrichB0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrateFluka71649
DMSOSigma Aldrich276855
DNA oligonucleotidesIntegrated DNA Technologiessynthesis of custom sequences
EDTA disodiumSigma AldrichE5134
FormamideFluka40248H351-360D-373
Gel imagerGE HealtcareSTORM B40
GlycerolSigma AldrichG5516
Micro tubes 0.5 mLSarstedt72.704
Potassium ChlorideSigma AldrichP9541
Sequencing apparatusBiometraModel S2
Silanization solution IFluka85126H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasicCarlo Erba480086
Speedvac concentratorThermo ScientificSavant DNA 120
TEMEDFluka87689R11-21/22-23-34
Tris-HClMERCK1.08387.2500
UreaSigma Aldrich51456
UV-Vis spectrophotometerThermo ScientificNanodrop 1000

References

  1. Davis, J. T. G-quartets 40 years later: from 5'-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry. Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).
  2. Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved