In vitro Cartographie chimique des structures de l’ADN G-quadruplex par Bis-3-chloropipéridines

Résumé

Les bis-3-chloropipéridines (B-CePs) sont des sondes chimiques utiles pour identifier et caractériser les structures G-quadruplex dans les matrices d’ADN in vitro. Ce protocole détaille la procédure permettant d’effectuer des réactions de sondage avec des B-CeP et de résoudre les produits de réaction par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à haute résolution.

Résumé

Les G-quadruplexes (G4s) sont des structures d’ADN biologiquement pertinentes, non canoniques, qui jouent un rôle important dans l’expression des gènes et les maladies, représentant des cibles thérapeutiques importantes. Des méthodes accessibles sont nécessaires pour la caractérisation in vitro de l’ADN dans les séquences potentielles de formation de G-quadruplex (PQS). Les B-CeP sont une classe d’agents alkylants qui se sont avérés être des sondes chimiques utiles pour l’étude de la structure d’ordre supérieur des acides nucléiques. Cet article décrit un nouveau test de cartographie chimique exploitant la réactivité spécifique des B-CeP avec le N7 des guanines, suivi d’un clivage direct des brins au niveau des G alkylés.

En effet, pour distinguer les plis G4 des formes d’ADN dépliées, nous utilisons B-CeP 1 pour sonder l’aptamère de liaison à la thrombine (TBA), un ADN de 15 mères capable d’assumer l’arrangement G4. La réaction des guanines répondant au B-CeP avec le B-CeP 1 permet d’obtenir des produits qui peuvent être résolus par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) à haute résolution au niveau d’un seul nucléotide en localisant les adduits d’alkylation individuels et le clivage des brins d’ADN au niveau des guanines alkylées. La cartographie à l’aide de B-CePs est un outil simple et puissant pour la caractérisation in vitro de séquences d’ADN formant G-quadruplex, permettant la localisation précise des guanines impliquées dans la formation des G-tétrades.

Introduction

En plus de la double hélice typique de Watson-Crick, les acides nucléiques peuvent adopter diverses structures secondaires, telles que la forme alternative G-quadruplex (G4), en raison de leurs séquences riches en guanine. La structure G4 est basée sur la formation de tétramères planaires, appelés G-tétrades, dans lesquels quatre guanines interagissent par l’intermédiaire de liaisons hydrogène Hoogsteen. Les G-tétrades sont empilées et stabilisées par des cations monovalents qui sont coordonnés au centre du noyau de guanine (Figure 1)¹.

Protocole

1. Préparation de la sonde d’acide nucléique et chimique

1. Acides nucléiques
   REMARQUE : L’oligonucléotide nommé « TBA » est la séquence d’ADN 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-TGG-3' de 15 mères marquée à l’extrémité 3' par le fluorophore 5-carboxyfluorescéine (FAM) pour permettre la visualisation sur le gel. L’oligonucléotide non marqué « cTBA » est sa séquence complémentaire d’ADN 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. TBA et cTBA sont utilisés pour obtenir les trois structures différentes, comme le montre le tableau 1.
   1. Embouts d’autoclave et tubes de 0,5 mL afin d’obtenir des produits jetables stériles et d’éviter la contamination.
   ....

Discussion

Les G-quadruplexes sont des structures secondaires d’acides nucléiques qui se replient généralement dans des séquences d’ADN riches en guanine et sont des cibles de recherche importantes en raison de leur association avec le contrôle génétique et les maladies. La cartographie chimique par B-CePs est un protocole utile pour la caractérisation des G4 de l’ADN, qui peut être utilisé pour identifier les bases de guanine impliquées dans la formation des G-tétrades dans des conditions physiologiques de sel.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide/bis-acrylamide solution 40%	Applichem	A3658	R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS)	Sigma Aldrich	A7460
Analytical balance	Mettler Toledo
Autoclave	pbi international
Boric acid	Sigma Aldrich	B0252
Bromophenol blue Brilliant blue R	Sigma Aldrich	B0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate	Fluka	71649
DMSO	Sigma Aldrich	276855
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	synthesis of custom sequences
EDTA disodium	Sigma Aldrich	E5134
Formamide	Fluka	40248	H351-360D-373
Gel imager	GE Healtcare	STORM B40
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Micro tubes 0.5 mL	Sarstedt	72.704
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Sequencing apparatus	Biometra	Model S2
Silanization solution I	Fluka	85126	H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasic	Carlo Erba	480086
Speedvac concentrator	Thermo Scientific	Savant DNA 120
TEMED	Fluka	87689	R11-21/22-23-34
Tris-HCl	MERCK	1.08387.2500
Urea	Sigma Aldrich	51456
UV-Vis spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 1000