In Vitro (시험관) Bis-3-Chloropiperidines에 의한 G-Quadruplex DNA 구조의 화학적 매핑

요약

Bis-3-chloropiperidines(B-CeP)는 in vitro에서 DNA 템플릿의 G-quadruplex 구조를 식별하고 특성화하는 데 유용한 화학 프로브입니다. 이 프로토콜은 B-CeP를 사용하여 프로빙 반응을 수행하고 고분해능 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 반응 생성물을 분해하는 절차를 자세히 설명합니다.

초록

G-quadruplex(G4s)는 유전자 발현 및 질병에 중요한 역할을 하는 생물학적으로 관련된 비표준 DNA 구조로, 중요한 치료 표적을 나타냅니다. 잠재적인 G-quadruplex-forming sequences(PQS) 내에서 DNA의 in vitro 특성 분석을 위해서는 접근 가능한 방법이 필요합니다. B-CeP는 핵산의 고차원 구조 조사에 유용한 화학 프로브로 입증된 알킬화제의 한 종류입니다. 이 논문은 B-CeP와 구아닌의 N7의 특정 반응성을 활용한 후 알킬화된 Gs에서 직접 가닥 절단을 수행하는 새로운 화학 매핑 분석에 대해 설명합니다.

즉, G4 접힘과 풀린 DNA 형태를 구별하기 위해 B-CeP 1을 사용하여 G4 배열을 가정할 수 있는 15-mer DNA인 트롬빈 결합 압타머(TBA)를 조사합니다. B-CeP 반응 구아닌과 B-CeP 1의 반응은 알킬화된 구아닌에서 개별 알킬화 부가물 및 DNA 가닥 절단을 찾아 단일 뉴클레오티드 수준에서 고분해능 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)으로 분해할 수 있는 산물을 생성합니다. B-CeP를 사용한 맵핑은 G-quadruplex 형성 DNA 염기서열의 in vitro 특성 분석을 위한 간단하고 강력한 도구로, G-tetrads 형성에 관여하는 구아닌의 정확한 위치를 파악할 수 있습니다.

서문

전형적인 왓슨-크릭(Watson-Crick) 이중나선 외에도, 핵산은 구아닌이 풍부한 서열로 인해 양자택일 G-4중(G4) 형태와 같은 다양한 2차 구조를 채택할 수 있습니다. G4 구조는 4개의 구아닌이 Hoogsteen 수소 결합을 통해 상호 작용하는 G-tetrads라고 하는 평면 사량체의 형성을 기반으로 합니다. G-tetrad는 구아닌 코어의 중심에서 조정되는 1가 양이온에 의해 적층되고 더욱 안정화됩니다(그림 1)¹.

그림 1: G-quadruplex 구조 의 개략도. (A) G-tetrad의 개략적 표현. 평면 어레이는 Hoogsteen 염기쌍과 중심 양이온(M⁺)에 의해 안정화됩니다. 

프로토콜

1. 핵산 및 화학 탐침 준비

1. 핵산
   참고: "TBA"라는 올리고뉴클레오티드는 형광단 5-카르복시플루오레세인(FAM)에 의해 3'-말단에 표지된 15-mer DNA 서열 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3'으로 겔에 시각화를 가능하게 합니다. 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드 "cTBA"는 DNA 상보적 서열 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'입니다. 표 1에 나타낸 바와 같이 3개의 상이한 구조를 얻기 위해 TBA 및 cTBA가 채용된다.
   1. 오토클레이브 팁과 0.5mL 튜브를 사용하여 멸균 일회용품을 얻고 오염을 방지할 수 있습니다.
   2. 각 올리고뉴클레오티드를 초순수에 최종 농도 100μM까지 용해시키는 원액을 준비합니다. 제조업체에서 제공한 260nm의 흡광 계수를 사용하여 자외선 가시광선(UV-Vis) 분광 광도계로 정확한 올리고뉴클레오티드 농도를 결정합니다.
      참고: 흡광 계수: TBA 및 cTBA에는 각각 164,300 M-1 cm-1 및 138,600 ^{M-1 cm-1}이 사용되었습니다.
   3. TBA 및 cTBA 원액을 -20°C에서 보관하십시오(이러한 조건에서 몇....

토론

G-quadruplex는 일반적으로 구아닌이 풍부한 DNA 염기서열 내에서 접히는 핵산 2차 구조이며, 유전적 제어 및 질병과의 연관성 때문에 중요한 연구 대상입니다. B-CePs에 의한 화학적 매핑은 생리학적 염분 조건에서 G-tetrads의 형성에 관여하는 구아닌 염기를 식별하는 데 사용할 수 있는 DNA G4의 특성 분석에 유용한 프로토콜입니다.

이 프로토콜에 사용된 화학 프로브는 B-CeP 1(

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide/bis-acrylamide solution 40%	Applichem	A3658	R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS)	Sigma Aldrich	A7460
Analytical balance	Mettler Toledo
Autoclave	pbi international
Boric acid	Sigma Aldrich	B0252
Bromophenol blue Brilliant blue R	Sigma Aldrich	B0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate	Fluka	71649
DMSO	Sigma Aldrich	276855
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	synthesis of custom sequences
EDTA disodium	Sigma Aldrich	E5134
Formamide	Fluka	40248	H351-360D-373
Gel imager	GE Healtcare	STORM B40
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Micro tubes 0.5 mL	Sarstedt	72.704
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Sequencing apparatus	Biometra	Model S2
Silanization solution I	Fluka	85126	H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasic	Carlo Erba	480086
Speedvac concentrator	Thermo Scientific	Savant DNA 120
TEMED	Fluka	87689	R11-21/22-23-34
Tris-HCl	MERCK	1.08387.2500
Urea	Sigma Aldrich	51456
UV-Vis spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 1000