In vitro Mapeo químico de estructuras de ADN G-cuádruple por bis-3-cloropiperidinas

Resumen

Las bis-3-cloroperiperidinas (B-CeP) son sondas químicas útiles para identificar y caracterizar estructuras G-cuádruples en plantillas de ADN in vitro. Este protocolo detalla el procedimiento para realizar reacciones de sondeo con B-CePs y para resolver los productos de reacción mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de alta resolución.

Resumen

Los G-cuádruples (G4) son estructuras de ADN no canónicas biológicamente relevantes que desempeñan un papel importante en la expresión génica y las enfermedades, representando importantes dianas terapéuticas. Se requieren métodos accesibles para la caracterización in vitro del ADN dentro de posibles secuencias formadoras de G-cuádruples (PQS). Los B-CeP son una clase de agentes alquilantes que han demostrado ser sondas químicas útiles para la investigación de la estructura de orden superior de los ácidos nucleicos. En este trabajo se describe un nuevo ensayo de mapeo químico que explota la reactividad específica de los B-CeP con el N7 de las guaninas, seguido de la escisión directa de la hebra en los Gs alquilados.

Es decir, para distinguir los pliegues G4 de las formas de ADN desplegadas, utilizamos B-CeP 1 para sondear el aptámero de unión a trombina (TBA), un ADN de 15 meros capaz de asumir la disposición G4. La reacción de las guaninas que responden a B-CeP con B-CeP 1 produce productos que pueden resolverse mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) de alta resolución a nivel de un solo nucleótido mediante la localización de aductos de alquilación individuales y la escisión de la cadena de ADN en las guaninas alquiladas. El mapeo mediante B-CePs es una herramienta sencilla y potente para la caracterización in vitro de secuencias de ADN formadoras de G-cuádruples, lo que permite la localización precisa de guaninas implicadas en la formación de G-tétradas.

Introducción

Además de la típica doble hélice de Watson-Crick, los ácidos nucleicos pueden adoptar varias estructuras secundarias, como la forma alternativa G-quadruplex (G4), debido a sus secuencias ricas en guanina. La estructura de G4 se basa en la formación de tetrámeros planos, llamados G-tétradas, en los que cuatro guaninas interactúan a través de enlaces de hidrógeno de Hoogsteen. Las tétradas G se apilan y se estabilizan aún más mediante cationes monovalentes que se coordinan en el centro del núcleo de guanina (Figura 1)¹.

Protocolo

1. Preparación de ácido nucleico y sonda química

1. Ácidos nucleicos
   NOTA: El oligonucleótido llamado "TBA" es la secuencia de ADN de 15 meros 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3' marcada en el extremo 3' por el fluoróforo 5-carboxifluoresceína (FAM) para permitir la visualización en el gel. El oligonucleótido no marcado "cTBA" es su secuencia complementaria de ADN 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. TBA y cTBA se emplean para obtener las tres estructuras diferentes, como se muestra en la Tabla 1.
   1. Puntas de autoclave y tubos de 0,5 mL para obtener desechables estériles y evitar la contaminación.
   2. Preparar soluciones madre solub....

Discusión

Los G-cuádruples son estructuras secundarias de ácidos nucleicos que normalmente se pliegan dentro de secuencias de ADN ricas en guanina, y son importantes objetivos de investigación debido a su asociación con el control genético y las enfermedades. El mapeo químico por B-CePs es un protocolo útil para la caracterización de los G4 de ADN, que se puede utilizar para identificar las bases de guanina involucradas en la formación de G-tétradas en condiciones fisiológicas de sal.

La sond.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide/bis-acrylamide solution 40%	Applichem	A3658	R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS)	Sigma Aldrich	A7460
Analytical balance	Mettler Toledo
Autoclave	pbi international
Boric acid	Sigma Aldrich	B0252
Bromophenol blue Brilliant blue R	Sigma Aldrich	B0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate	Fluka	71649
DMSO	Sigma Aldrich	276855
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	synthesis of custom sequences
EDTA disodium	Sigma Aldrich	E5134
Formamide	Fluka	40248	H351-360D-373
Gel imager	GE Healtcare	STORM B40
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Micro tubes 0.5 mL	Sarstedt	72.704
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Sequencing apparatus	Biometra	Model S2
Silanization solution I	Fluka	85126	H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasic	Carlo Erba	480086
Speedvac concentrator	Thermo Scientific	Savant DNA 120
TEMED	Fluka	87689	R11-21/22-23-34
Tris-HCl	MERCK	1.08387.2500
Urea	Sigma Aldrich	51456
UV-Vis spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 1000