In Vitro Химическое картирование структур ДНК G-квадруплекса бис-3-хлорпиперидинами

Резюме

Бис-3-хлорпиперидины (B-CeP) являются полезными химическими зондами для идентификации и характеристики структур G-квадруплекса в матрицах ДНК in vitro. В этом протоколе подробно описана процедура проведения зондирующих реакций с B-CeP и растворения продуктов реакции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле высокого разрешения.

Аннотация

G-квадруплексы (G4) — это биологически значимые, неканонические структуры ДНК, которые играют важную роль в экспрессии генов и заболеваниях, представляя собой важные терапевтические мишени. Для характеристики ДНК in vitro в потенциальных G-квадруплекс-образующих последовательностях (PQS) требуются доступные методы. B-CeP — это класс алкилирующих агентов, которые оказались полезными химическими зондами для исследования структуры нуклеиновых кислот высшего порядка. В данной работе описывается новый химический картирующий анализ, использующий специфическую реакционную способность B-CeP с N7 гуанинов с последующим прямым расщеплением цепей в алкилированных Gs.

А именно, чтобы отличить складки G4 от развернутых форм ДНК, мы используем B-CeP 1 для зондирования тромбин-связывающего аптамера (TBA), 15-мерной ДНК, способной принимать расположение G4. Реакция B-CeP-реагирующих гуанинов с B-CeP 1 дает продукты, которые могут быть разрешены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) высокого разрешения на однонуклеотидном уровне путем локализации отдельных аддуктов алкилирования и расщепления цепей ДНК на алкилированных гуанинах. Картирование с использованием B-CePs является простым и мощным инструментом для характеристики in vitro последовательностей ДНК, образующих G-квадруплекс, что позволяет точно определить местоположение гуанинов, участвующих в образовании G-тетрад.

Введение

В дополнение к типичной двойной спирали Уотсона-Крика, нуклеиновые кислоты могут принимать различные вторичные структуры, такие как альтернативная форма G-квадруплекса (G4), из-за их богатых гуанином последовательностей. Структура G4 основана на образовании плоских тетрамеров, называемых G-тетрадами, в которых четыре гуанина взаимодействуют через водородные связи Хугстина. G-тетрады укладываются друг на друга и дополнительно стабилизируются одновалентными катионами, которые координируются в центре гуанинового ядра (рис. 1)1.

Рисунок 1: Схематическое изображение G-квадруплексной структуры. (A) Схематическое изображение G-тетрады. Планарная решетка стабилизируется спариванием оснований по Хугстину и центральным катионом (M⁺). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Последовательности, содержащие четыре или более последовательных прогонов, по крайней мере, двух последовательных гуаниновых нуклеотидов, являются потенциальными G-квадруплекс-образующими последовательностями (PQS), которые могут сворачиваться в G-квадруплексные структуры. PQS расположены во многих различных клеточных контекстах, таких как теломеры, промоторы генов, рибосомная ДНК и рекомбинационные сайты, и участвуют в регуляции многих биологических^{процессов.} Таким образом, идентификация и экспериментальная проверка G4 в геноме человека, которая в настоящее время осуществляется в основном с помощью вычислительных инструментов, является биологически значимой^{проблемой.} Для поддержки вычислительных прогнозов или обнаружения непредсказанных структур G4 здесь показан доступный метод, основанный на химическом картировании, для идентификации образования G4 в матрице ДНК, позволяющий точно идентифицировать гуанины, образующие структуру G-тетрады.

В представленном химическом картированном анализе используется различная реакционная способность бис-3-хлорпиперидинов (B-CeP) с гуанинами после образования структур G4. Благодаря своей высокой реакционной способности с нуклеофилами 4,5,6,7,8,9^, B-CeP являются алкилирующими агентами нуклеиновых кислот, обладающими способностью очень эффективно реагировать с положением N7гуаниновых нуклеотидов¹⁰. Алкилирование сопровождается депуринацией и расщеплением цепей в одноцепочечных и двухцепочечных конструкциях ДНК. Напротив, гуанины, участвующие в образовании G-тетрад в G4-расположениях, невосприимчивы к алкилированию B-CeP, так как положение N7 гуанинов вовлечено в водородные связи Хугстина. Эта специфическая реакционная способность B-CeP позволяет не только обнаруживать структуры G4, но и идентифицировать гуанины, образующие тетраду (тетрады), поскольку они могут быть выведены из их относительной защиты от алкилирования по сравнению с гуанинами в одноцепочечной и двухцепочечной ДНК.

Протокол химического картирования представлен здесь с использованием B-CeP 1 (рис. 2A) в качестве зонда для характеристики тромбин-связывающего аптамера (TBA), 15-мерной ДНК, способной принимать расположение G4 в присутствии катионов калия^11,12. Расположение G4 TBA (G4-TBA) напрямую сравнивается с двумя контрольными группами, а именно TBA в одноцепочечной форме (ssTBA) и TBA, отожженной до ее комплементарной последовательности с образованием двухцепочечной конструкции (dsTBA) (табл. 1). Продукты зондирующих реакций растворяются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) высокого разрешения на однонуклеотидном уровне путем локализации отдельных аддуктов алкилирования и расщепления цепей ДНК на алкилированных гуанинах. Визуализация на геле обеспечивается конъюгацией олигонуклеотида TBA с флуорофором на его 3'-конце (табл. 1). В этом протоколе показано, как сворачивать TBA в различных конформациях (G4 и контроль), а также как проводить зондирующие реакции с B-CeP с последующим PAGE.

протокол

1. Подготовка нуклеиновых кислот и химических зондов

1. Нуклеиновые кислоты
   ПРИМЕЧАНИЕ: Олигонуклеотид под названием «TBA» представляет собой 15-мерную последовательность ДНК 5'-GGT-TGG-TGG-TGT-GGT-TGG-3', помеченную на 3'-конце флуорофором 5-карбоксифлуоресцеином (FAM) для обеспечения визуализации на геле. Немеченый олигонуклеотид "cTBA" представляет собой его комплементарную последовательность ДНК 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. TBA и cTBA используются для получения трех различных структур, как показано в таблице 1.
   1. Наконечники для автоклавов и пробирки по 0,5 мл для получения стерильных одноразовых материалов и избежания загрязнения.
   2. Готовят исходные растворы, растворяющие каждый олигонуклеотид в сверхчистой воде до конечной концентрации 100 мкМ. Точную концентрацию олигонуклеотидов определяют с помощью спектрофотометра в ультрафиолетовом диапазоне видимого диапазона (UV-Vis), используя коэффициент экстинкции при 260 нм, предоставленный производителем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициенты экстинкции: 164 300 М-1 см-1 и 138 600 М-1 ^см-1 были использованы для TBA и cTBA, соответственно.
   3. Храните исходные растворы TBA и cTBA при температуре -20 °C (в течение нескольких месяцев в этих условиях).
2. Соединение B-CeP 1
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соединение B-CeP 1 синтезируется, как сообщалось ранее⁶.
   1. Приготовьте исходный раствор B-CeP 1 при ~10 мМ. Взвесьте ~1 мг лиофилизированного соединения с помощью аналитических весов, расположенных в вытяжном шкафу, и растворите его в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО).
   2. Рассчитайте точную концентрацию соединения на основе фактического количества используемого соединения и ДМСО (d = 1,1 г/^см3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда обращайтесь с соединением в перчатках (как при лиофилизации, так и при растворении в ДМСО)^13,14.

Таблица 1: Олигонуклеотидные структуры, используемые в данном протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

2. Сворачивание конструкций нуклеиновых кислот

1. Подготовка буферов
   1. Приготовьте буферный раствор BPE (бифосфат-этилендиаминтетрауксусная кислота [ЭДТА], 5x: 2 мМ₂PO 4, 6 мМ Na2 HPO 4, 1 мМ_Na2ЭДТА, pH_7,4) и раствор 500 мМ KCl в сверхчистой воде. Отфильтруйте растворы через фильтры с размером пор 0,22 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов используйте свежеприготовленные растворы. Буфер BPE можно хранить при температуре 4 °C до 15 дней.
2. Сворачивание образцов G4-TBA, ssTBA и dsTBA методом повторного складывания
   ПРИМЕЧАНИЕ: Катионы калия необходимы для сворачивания структуры G4 (G4-TBA). Не добавляйте катионы калия в раствор для сворачивания органов управления ssTBA и dsTBA.
   1. Приготовьте 40 мкл 4 мкМ раствора G4-TBA в 1x BPE и 100 мМ KCl. Денатурируют раствор олигонуклеотида G4-TBA, нагревая пробирку до 95 °C в течение 5 мин, и медленно охлаждают ее до комнатной температуры (RT), чтобы TBA сложилась в G-квадруплексы.
   2. Приготовьте 40 мкл 4 мкМ раствора ssTBA в 1x BPE. Выполните процедуру термического складывания, как описано в шаге 2.2.1, чтобы сложить TBA в одноцепочечной форме.
   3. Приготовьте 40 мкл 4 мкМ раствора дцТБА путем смешивания эквимолярных количеств ТБА и цТБА в 1х BPE. Выполните процедуру термического складывания, как описано выше (шаг 2.2.1), для отжига TBA до его комплементарной последовательности cTBA и формирования двухцепочечной формы TBA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный объем каждого складного раствора зависит от количества образцов для зондирующих реакций, учитывая, что для каждого образца потребуется 5 мкл раствора 4 мкМ. Приготовьте немного избыточного объема каждого раствора, чтобы избежать ошибок при пипетировании.

3. Зондирующие реакции

ПРИМЕЧАНИЕ: Зондирующие реакции должны быть выполнены сразу после процедуры термического складывания.

1. Когда фальцовочные растворы G4-TBA, ssTBA и dsTBA остынут до RT, проводят центрифугирование с коротким отжимом (7 000 × г в течение 5-8 с при RT) и начинают зондирующие реакции.
2. Подготовьте 21 пустую автоклавную пробирку объемом 0,5 мл. Организуйте их в три набора по семь пробирок в каждом на стойке для лабораторных образцов, как указано в таблице 2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый набор столбцов соответствует трем различным условиям свертывания TBA: G4-TBA, ssTBA и dsTBA. Каждый ряд соответствует трем различным срокам инкубации. Каждая ячейка в столбце соответствует конечной концентрации зонда B-CeP 1 (табл. 2). Убедитесь, что на тюбиках есть четкая маркировка.
3. Добавьте в каждую пробирку по 3 мкл сверхчистой воды.
4. Добавьте 5 мкл свернутого G4-TBA в каждую пробирку первого набора (шаг 3.2). Добавьте 5 мкл свернутого ssTBA в каждую пробирку второго набора. Добавьте 5 мкл свернутого dsTBA в каждую пробирку третьего набора.
5. Разбавьте исходный раствор B-CeP 1 до 250 мкМ и 25 мкМ в сверхчистой воде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разведения химического зонда B-CeP 1 должны быть свежеприготовленными и немедленно вступить в реакцию с субстратом ДНК, чтобы избежать конкурирующих реакций с водой.
6. Добавьте к образцам 2 мкл соответствующего разведения B-CeP 1 (25 мкМ и 250 мкМ). Замените соединение сверхчистой водой в трех контрольных образцах (С) для анализа по-разному свернутых TBA в отсутствие соединения. Инкубируют все образцы при температуре 37 °C.
7. Через 1 ч, 4 ч и 15 ч инкубации остановите реакцию, поместив пробирки при -20 °C до следующего этапа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить в этих условиях в течение нескольких дней.
8. Высушите образцы в вакуумной центрифуге.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Высушенные образцы можно хранить при температуре -20 °C в течение нескольких недель, прежде чем приступить к анализу PAGE.

Таблица 2: Образцы для зондирующих реакций (структуры, концентрации зондов и время инкубации). Каждый набор столбцов соответствует трем различным условиям свертывания TBA (G4-TBA, ssTBA и dsTBA). Каждый ряд соответствует трем различным срокам инкубации (1, 4, 15 ч). Каждая ячейка в колонке соответствует конечной концентрации зонда B-CeP 1 (5 или 50 мкМ). Контроль (С) для каждого набора соответствует образцу по-разному сложенных ТБА, инкубированных в течение более длительного времени (15 ч) в отсутствие соединения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

4. СТРАНИЦА с высоким разрешением

1. Приготовление денатурирующего раствора полиакриламида
   ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее приготовьте 500 мл 20% денатурирующего раствора полиакриламидного геля. Для каждого эксперимента будет использовано около 80 мл этого раствора. Используйте бутылку из янтарного стекла или накройте стеклянную бутылку алюминиевой фольгой для хранения раствора в RT.
   ВНИМАНИЕ: Полиакриламид нейротоксичен. На всех этапах приготовления и заливки геля надевайте перчатки и лабораторный халат. Выбросьте полимеризованный акриламид в соответствующую коробку для загрязненных материалов.
   1. Взвесьте 210 г мочевины в стакане объемом 1 л. Добавьте 250 мл 40% раствора акриламида/бисакриламида (19/1) и 50 мл 10x клещевого энцефалита (890 мМ Tris-HCl, 890 мМ борат, 20 мМ ЭДТА, pH 8).
   2. Поместите стакан на пластину для перемешивания и перемешайте раствор с помощью мешалки. Накройте стакан алюминиевой фольгой во время смешивания, чтобы предотвратить разбрызгивание и загрязнение.
   3. Перемешивайте раствор до полного растворения мочевины и прозрачности раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может занять много часов. Чтобы ускорить растворение мочевины, добавьте небольшую аликвоту воды, не выходя за пределы желаемого конечного объема.
   4. Снимите стержень мешалки. Перелейте раствор в цилиндр и добавьте воды до точного конечного объема 500 мл.
2. Настройка гелевого аппарата
   1. Очистите две пластины (одну с насечкой и одну без насечки) 70% этиловым спиртом, дайте им высохнуть, а затем обработайте пластины раствором диметилдихлорсилана.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Силанизацию можно пропустить, хотя она помогает высвобождению геля из одной из пластин при разборке гелевого сэндвича.
      ВНИМАНИЕ: Работайте с раствором силанизации в перчатках и проводите обработку пластин этим раствором в вытяжном шкафу.
   2. Поместите распорки 0,4 мм вдоль длинных краев длинной пластины, поместите короткую пластину поверх другой и совместите две пластины внизу.
   3. Наклейте несколько слоев бумажной ленты по всем краям, кроме верхней.
   4. Чтобы избежать протечек при отливке, добавьте дополнительный слой скотча на дно геля.
   5. Закрепите боковые стороны стеклянного сэндвича чистыми зажимами, следуя инструкциям поставщика (разные поставщики используют немного разные приспособления, зажимы для сэндвичей и прокладки).
3. Заливка геля
   ПРИМЕЧАНИЕ: Заливайте гель при RT (25 °C), так как полимеризация полиакриламида чувствительна к температуре.
   1. Непосредственно перед применением в стакан наливают 80 мл заранее приготовленного денатурирующего раствора полиакриламида (шаг 4.1), 450 мкл 10% раствора персульфата аммония (APS) и 45 мкл тетраметилэтилендиамина (TEMED).
   2. Смешайте раствор и быстро вылейте его между стеклянными пластинами с помощью шприца объемом 50 мл. Введите расческу с нужным количеством углублений между стеклянными пластинами, избегая пузырей. При необходимости добавьте гелевый раствор, чтобы заполнить бутерброд полностью. Поместите четыре зажима на гребень, чтобы прижать и обеспечить равномерное распределение лунок.
   3. Дайте гелю полимеризоваться не менее 45 минут.
4. Запуск геля
   1. После полимеризации снимите все зажимы и слои бумажной ленты. Медленно снимите гребень и тщательно промойте лунки дистиллированной водой.
   2. Следуйте инструкциям конкретного поставщика, чтобы правильно поместить гелевый сэндвич в вертикальный аппарат гель-электрофореза.
   3. Приготовьте проточный буфер для клещевого КЛЕФА (1x: 89 мМ Tris-HCl, 89 мМ борат, 2 мМ ЭДТА, pH 8) в деионизированной воде и заполните буфером верхний и нижний резервуары.
   4. Разогрейте пластины, выполнив предварительный прогон гель-электрофореза не менее 30 мин при мощности 50 Вт.
   5. Приготовьте денатурирующий гелевый загрузочный буфер (DGLB: 1 M Tris-HCl, 80% формамид, 50% глицерин, 0,05% бромфеноловый синий) в сверхчистой воде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: GLB помогает отслеживать движение образцов олигонуклеотидов в гелевую систему и позволяет загружать образцы в лунки геля. Присутствие денатурирующего агента формамида позволяет разделять виды ДНК в соответствии с размером, даже в неденатурирующем PAGE.
   6. Суспендант высушенных образцов (образцы из этапа 3.8) в 5 мкл ГЛБ.
   7. Перед загрузкой образцов очистите лунки с помощью небольшого шприца и буфера КЛЕЩ в верхней буферной камере, чтобы удалить мочевину из лунок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите этот шаг несколько раз, чтобы точно очистить лунки, тем самым избегая полос, которые трудно интерпретировать.
   8. Загрузите образцы в чистые лунки и запишите порядок загрузки.
   9. Выполняйте гель-электрофорез в течение 2 ч при мощности 50 Вт или, по крайней мере, до тех пор, пока бромфеноловый синий краситель не заполнит гель на 2/3.
5. Визуализация геля
   1. После электрофореза отключите питание, снимите стеклянный сэндвич и очистите стаканы.
   2. Обнаружение флуоресценции олигонуклеотидных полос, меченных FAM, путем сканирования с помощью гелевого тепловизора.

Результаты

На рисунке 2 показан репрезентативный результат проведенного химического картирования, как описано в протоколе, с B-CeP 1 на олигонуклеотиде TBA, свернутом в три различные структуры. TG-квадруплексное расположение TBA (G4-TBA) было получено путем сворачивания олигонуклеотида в BP...

Обсуждение

G-квадруплексы представляют собой вторичные структуры нуклеиновых кислот, которые обычно сворачиваются в богатых гуанином последовательностях ДНК и являются важными объектами исследований из-за их связи с генетическим контролем и заболеваниями. Химическое картирование с помощью B-CeP...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide/bis-acrylamide solution 40%	Applichem	A3658	R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS)	Sigma Aldrich	A7460
Analytical balance	Mettler Toledo
Autoclave	pbi international
Boric acid	Sigma Aldrich	B0252
Bromophenol blue Brilliant blue R	Sigma Aldrich	B0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate	Fluka	71649
DMSO	Sigma Aldrich	276855
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	synthesis of custom sequences
EDTA disodium	Sigma Aldrich	E5134
Formamide	Fluka	40248	H351-360D-373
Gel imager	GE Healtcare	STORM B40
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Micro tubes 0.5 mL	Sarstedt	72.704
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Sequencing apparatus	Biometra	Model S2
Silanization solution I	Fluka	85126	H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasic	Carlo Erba	480086
Speedvac concentrator	Thermo Scientific	Savant DNA 120
TEMED	Fluka	87689	R11-21/22-23-34
Tris-HCl	MERCK	1.08387.2500
Urea	Sigma Aldrich	51456
UV-Vis spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 1000