In Vitro Химическое картирование структур ДНК G-квадруплекса бис-3-хлорпиперидинами

Резюме

Бис-3-хлорпиперидины (B-CeP) являются полезными химическими зондами для идентификации и характеристики структур G-квадруплекса в матрицах ДНК in vitro. В этом протоколе подробно описана процедура проведения зондирующих реакций с B-CeP и растворения продуктов реакции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле высокого разрешения.

Аннотация

G-квадруплексы (G4) — это биологически значимые, неканонические структуры ДНК, которые играют важную роль в экспрессии генов и заболеваниях, представляя собой важные терапевтические мишени. Для характеристики ДНК in vitro в потенциальных G-квадруплекс-образующих последовательностях (PQS) требуются доступные методы. B-CeP — это класс алкилирующих агентов, которые оказались полезными химическими зондами для исследования структуры нуклеиновых кислот высшего порядка. В данной работе описывается новый химический картирующий анализ, использующий специфическую реакционную способность B-CeP с N7 гуанинов с последующим прямым расщеплением цепей в алкилированных Gs.

А именно, чтобы отличить складки G4 от развернутых форм ДНК, мы используем B-CeP 1 для зондирования тромбин-связывающего аптамера (TBA), 15-мерной ДНК, способной принимать расположение G4. Реакция B-CeP-реагирующих гуанинов с B-CeP 1 дает продукты, которые могут быть разрешены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) высокого разрешения на однонуклеотидном уровне путем локализации отдельных аддуктов алкилирования и расщепления цепей ДНК на алкилированных гуанинах. Картирование с использованием B-CePs является простым и мощным инструментом для характеристики in vitro последовательностей ДНК, образующих G-квадруплекс, что позволяет точно определить местоположение гуанинов, участвующих в образовании G-тетрад.

Введение

В дополнение к типичной двойной спирали Уотсона-Крика, нуклеиновые кислоты могут принимать различные вторичные структуры, такие как альтернативная форма G-квадруплекса (G4), из-за их богатых гуанином последовательностей. Структура G4 основана на образовании плоских тетрамеров, называемых G-тетрадами, в которых четыре гуанина взаимодействуют через водородные связи Хугстина. G-тетрады укладываются друг на друга и дополнительно стабилизируются одновалентными катионами, которые координируются в центре гуанинового ядра (рис. 1)1.

протокол

1. Подготовка нуклеиновых кислот и химических зондов

1. Нуклеиновые кислоты
   ПРИМЕЧАНИЕ: Олигонуклеотид под названием «TBA» представляет собой 15-мерную последовательность ДНК 5'-GGT-TGG-TGG-TGT-GGT-TGG-3', помеченную на 3'-конце флуорофором 5-карбоксифлуоресцеином (FAM) для обеспечения визуализации на геле. Немеченый олигонуклеотид "cTBA" представляет собой его комплементарную последовательность ДНК 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. TBA и cTBA используются для получения трех различных структур, как показано в таблице 1.
   1. Наконечники для автоклавов и пробирки по 0,5 мл для получения стерильных одноразовых материалов и избежани....

Результаты

На рисунке 2 показан репрезентативный результат проведенного химического картирования, как описано в протоколе, с B-CeP 1 на олигонуклеотиде TBA, свернутом в три различные структуры. TG-квадруплексное расположение TBA (G4-TBA) было получено путем сворачивания олигонуклеотида в BP.......

Обсуждение

G-квадруплексы представляют собой вторичные структуры нуклеиновых кислот, которые обычно сворачиваются в богатых гуанином последовательностях ДНК и являются важными объектами исследований из-за их связи с генетическим контролем и заболеваниями. Химическое картирование с помощью B-CeP.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide/bis-acrylamide solution 40%	Applichem	A3658	R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS)	Sigma Aldrich	A7460
Analytical balance	Mettler Toledo
Autoclave	pbi international
Boric acid	Sigma Aldrich	B0252
Bromophenol blue Brilliant blue R	Sigma Aldrich	B0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate	Fluka	71649
DMSO	Sigma Aldrich	276855
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	synthesis of custom sequences
EDTA disodium	Sigma Aldrich	E5134
Formamide	Fluka	40248	H351-360D-373
Gel imager	GE Healtcare	STORM B40
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Micro tubes 0.5 mL	Sarstedt	72.704
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Sequencing apparatus	Biometra	Model S2
Silanization solution I	Fluka	85126	H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasic	Carlo Erba	480086
Speedvac concentrator	Thermo Scientific	Savant DNA 120
TEMED	Fluka	87689	R11-21/22-23-34
Tris-HCl	MERCK	1.08387.2500
Urea	Sigma Aldrich	51456
UV-Vis spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 1000