In vitro Chemische Kartierung von G-Quadruplex-DNA-Strukturen durch Bis-3-Chlorpiperidine

Zusammenfassung

Bis-3-Chloropiperidine (B-CePs) sind nützliche chemische Sonden, um G-Quadruplex-Strukturen in DNA-Matrizen in vitro zu identifizieren und zu charakterisieren. Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Durchführung von Sondierungsreaktionen mit B-CePs und zur Auflösung von Reaktionsprodukten durch hochauflösende Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

Zusammenfassung

G-Quadruplexe (G4s) sind biologisch relevante, nicht-kanonische DNA-Strukturen, die eine wichtige Rolle bei der Genexpression und bei Krankheiten spielen und wichtige therapeutische Ziele darstellen. Für die in vitro Charakterisierung von DNA innerhalb potenzieller G-Quadruplex-bildender Sequenzen (PQS) werden zugängliche Methoden benötigt. B-CePs sind eine Klasse von Alkylierungsmitteln, die sich als nützliche chemische Sonden für die Untersuchung der Struktur höherer Ordnung von Nukleinsäuren erwiesen haben. In dieser Arbeit wird ein neuer chemischer Mapping-Assay beschrieben, der die spezifische Reaktivität von B-CePs mit dem N7 von Guaninen ausnutzt, gefolgt von einer direkten Strangspaltung an den alkylierten Gs.

Um G4-Falten von ungefalteten DNA-Formen zu unterscheiden, verwenden wir B-CeP 1, um das Thrombin-bindende Aptamer (TBA) zu untersuchen, eine 15-mer-DNA, die in der Lage ist, die G4-Anordnung anzunehmen. Die Reaktion von B-CeP-antwortenden Guaninen mit B-CeP1 führt zu Produkten, die durch hochauflösende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) auf Einzelnukleotidebene aufgelöst werden können, indem einzelne Alkylierungsaddukte und DNA-Strangspaltung an den alkylierten Guaninen lokalisiert werden. Die Kartierung mit B-CePs ist ein einfaches und leistungsfähiges Werkzeug für die In-vitro-Charakterisierung von G-Quadruplex-bildenden DNA-Sequenzen, das die genaue Lokalisierung von Guaninen ermöglicht, die an der Bildung von G-Tetrades beteiligt sind.

Einleitung

Neben der typischen Watson-Crick-Doppelhelix können Nukleinsäuren aufgrund ihrer Guanin-reichen Sequenzen verschiedene Sekundärstrukturen annehmen, wie z.B. die alternative G-Quadruplex (G4)-Form. Die G4-Struktur basiert auf der Bildung von planaren Tetrameren, sogenannten G-Tetraden, in denen vier Guanine durch Hoogsteen-Wasserstoffbrückenbindungen wechselwirken. G-Tetraden werden durch monovalente Kationen, die im Zentrum des Guaninkerns koordiniert sind, gestapelt und weiter stabilisiert (Abbildung 1)¹.

Protokoll

1. Nukleinsäure- und chemische Sondenvorbereitung

1. Nukleinsäuren
   HINWEIS: Das Oligonukleotid mit der Bezeichnung "TBA" ist die 15-mer-DNA-Sequenz 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3', die am 3'-Ende durch das Fluorophor 5-Carboxyfluorescein (FAM) markiert wird, um die Visualisierung auf dem Gel zu ermöglichen. Das unmarkierte Oligonukleotid "cTBA" ist seine DNA-komplementäre Sequenz 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. TBA und cTBA werden verwendet, um die drei verschiedenen Strukturen zu erhalten, wie in Tabelle 1 dargestellt.
   1. Autoklavenspitzen und 0,5-ml-Röhrchen, um sterile Einwegartikel zu erhalten und Kontaminationen zu vermeiden.<....

Diskussion

G-Quadruplexe sind Nukleinsäure-Sekundärstrukturen, die sich typischerweise innerhalb von Guanin-reichen DNA-Sequenzen falten und aufgrund ihrer Assoziation mit genetischer Kontrolle und Krankheiten wichtige Forschungsziele sind. Die chemische Kartierung durch B-CePs ist ein nützliches Protokoll für die Charakterisierung von DNA-G4s, das verwendet werden kann, um die Guaninbasen zu identifizieren, die an der Bildung von G-Tetrades unter physiologischen Salzbedingungen beteiligt sind.

Die i.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide/bis-acrylamide solution 40%	Applichem	A3658	R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS)	Sigma Aldrich	A7460
Analytical balance	Mettler Toledo
Autoclave	pbi international
Boric acid	Sigma Aldrich	B0252
Bromophenol blue Brilliant blue R	Sigma Aldrich	B0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate	Fluka	71649
DMSO	Sigma Aldrich	276855
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	synthesis of custom sequences
EDTA disodium	Sigma Aldrich	E5134
Formamide	Fluka	40248	H351-360D-373
Gel imager	GE Healtcare	STORM B40
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Micro tubes 0.5 mL	Sarstedt	72.704
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Sequencing apparatus	Biometra	Model S2
Silanization solution I	Fluka	85126	H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasic	Carlo Erba	480086
Speedvac concentrator	Thermo Scientific	Savant DNA 120
TEMED	Fluka	87689	R11-21/22-23-34
Tris-HCl	MERCK	1.08387.2500
Urea	Sigma Aldrich	51456
UV-Vis spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 1000