In vitro Mappatura chimica delle strutture del DNA G-quadruplex mediante bis-3-cloroperidine

Riepilogo

Le bis-3-cloropepidine (B-CePs) sono sonde chimiche utili per identificare e caratterizzare le strutture G-quadruplex in modelli di DNA in vitro. Questo protocollo descrive in dettaglio la procedura per eseguire reazioni di sondaggio con B-CeP e per risolvere i prodotti di reazione mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide ad alta risoluzione.

Abstract

I G-quadruplex (G4) sono strutture di DNA biologicamente rilevanti e non canoniche che svolgono un ruolo importante nell'espressione genica e nelle malattie, rappresentando bersagli terapeutici significativi. Sono necessari metodi accessibili per la caratterizzazione in vitro del DNA all'interno di potenziali sequenze formanti G-quadruplex (PQS). I B-CeP sono una classe di agenti alchilanti che si sono dimostrati utili sonde chimiche per lo studio della struttura di ordine superiore degli acidi nucleici. Questo articolo descrive un nuovo saggio di mappatura chimica che sfrutta la reattività specifica dei B-CeP con l'N7 delle guanine, seguita da una scissione diretta del filamento ai G alchilati.

Vale a dire, per distinguere le pieghe G4 dalle forme di DNA non ripiegate, usiamo B-CeP 1 per sondare l'aptamero legante la trombina (TBA), un DNA a 15 mer in grado di assumere la disposizione G4. La reazione delle guaine che rispondono a B-CeP con B-CeP 1 produce prodotti che possono essere risolti mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) ad alta risoluzione a livello di singolo nucleotide localizzando i singoli addotti di alchilazione e la scissione del filamento di DNA sulle guanine alchilate. La mappatura mediante B-CeP è uno strumento semplice e potente per la caratterizzazione in vitro di sequenze di DNA formanti G-quadruplex, consentendo la localizzazione precisa delle guanine coinvolte nella formazione delle G-tetrade.

Introduzione

Oltre alla tipica doppia elica di Watson-Crick, gli acidi nucleici possono adottare varie strutture secondarie, come la forma alternativa G-quadruplex (G4), a causa delle loro sequenze ricche di guanina. La struttura G4 si basa sulla formazione di tetrameri planari, chiamati G-tetrade, in cui quattro guanine interagiscono attraverso legami idrogeno di Hoogsteen. Le G-tetradi sono impilate e ulteriormente stabilizzate da cationi monovalenti coordinati al centro del nucleo guaninico (Figura 1)¹.

Protocollo

1. Preparazione dell'acido nucleico e della sonda chimica

1. Acidi nucleici
   NOTA: L'oligonucleotide denominato "TBA" è la sequenza di DNA a 15 meri 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3' marcata all'estremità 3' dal fluoroforo 5-carbossifluoresceina (FAM) per consentire la visualizzazione sul gel. L'oligonucleotide non marcato "cTBA" è la sua sequenza complementare al DNA 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. TBA e cTBA sono impiegati per ottenere le tre diverse strutture, come mostrato nella Tabella 1.
   1. Puntali per autoclave e provette da 0,5 mL per ottenere prodotti monouso sterili ed evitare contaminazioni.
   2. Preparare soluzioni m....

Discussione

I G-quadruplex sono strutture secondarie di acido nucleico che tipicamente si ripiegano all'interno di sequenze di DNA ricche di guanina e sono obiettivi di ricerca significativi a causa della loro associazione con il controllo genetico e le malattie. La mappatura chimica mediante B-CePs è un protocollo utile per la caratterizzazione del DNA G4s, che può essere utilizzato per identificare le basi guaninica coinvolte nella formazione delle G-tetrade in condizioni fisiologiche di sale.

La sond.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide/bis-acrylamide solution 40%	Applichem	A3658	R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS)	Sigma Aldrich	A7460
Analytical balance	Mettler Toledo
Autoclave	pbi international
Boric acid	Sigma Aldrich	B0252
Bromophenol blue Brilliant blue R	Sigma Aldrich	B0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate	Fluka	71649
DMSO	Sigma Aldrich	276855
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	synthesis of custom sequences
EDTA disodium	Sigma Aldrich	E5134
Formamide	Fluka	40248	H351-360D-373
Gel imager	GE Healtcare	STORM B40
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Micro tubes 0.5 mL	Sarstedt	72.704
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Sequencing apparatus	Biometra	Model S2
Silanization solution I	Fluka	85126	H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasic	Carlo Erba	480086
Speedvac concentrator	Thermo Scientific	Savant DNA 120
TEMED	Fluka	87689	R11-21/22-23-34
Tris-HCl	MERCK	1.08387.2500
Urea	Sigma Aldrich	51456
UV-Vis spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 1000