In vitro Mapeamento químico de estruturas do DNA G-Quadruplex por bis-3-cloropiperidinas;

Resumo

Bis-3-cloropiperidinas (B-CePs) são sondas químicas úteis para identificar e caracterizar estruturas G-quadruplex em modelos de DNA in vitro. Este protocolo detalha o procedimento para realizar reações de sondagem com B-CePs e para resolver produtos da reação por eletroforese em gel de poliacrilamida de alta resolução.

Resumo

G-quadruplexes (G4s) são estruturas de DNA biologicamente relevantes, não canônicas, que desempenham um papel importante na expressão gênica e doenças, representando alvos terapêuticos significativos. Métodos acessíveis são necessários para a caracterização in vitro do DNA dentro de potenciais sequências formadoras de G-quadruplex (PQSs). B-CePs são uma classe de agentes alquilantes que provaram ser sondas químicas úteis para a investigação da estrutura de ordem superior dos ácidos nucléicos. Este trabalho descreve um novo ensaio de mapeamento químico explorando a reatividade específica de B-CePs com o N7 de guaninas, seguido de clivagem direta em Gs alquilada.

Ou seja, para distinguir as dobras G4 das formas de DNA desdobradas, usamos B-CeP 1 para sondar o aptâmero ligante de trombina (TBA), um DNA de 15 meros capaz de assumir o arranjo G4. A reação de guaninas que respondem a B-CeP com B-CeP 1 produz produtos que podem ser resolvidos por eletroforese em gel de poliacrilamida de alta resolução (PAGE) em nível de nucleotídeo único, localizando adutos de alquilação individuais e clivagem de fita de DNA nas guaninas alquiladas. O mapeamento utilizando B-CePs é uma ferramenta simples e poderosa para a caracterização in vitro de sequências de DNA formador de G-quadruplex, possibilitando a localização precisa de guaninas envolvidas na formação de G-tétrades.

Introdução

Além da típica dupla hélice de Watson-Crick, os ácidos nucléicos podem adotar várias estruturas secundárias, como a forma alternativa G-quadruplex (G4), devido às suas sequências ricas em guanina. A estrutura G4 é baseada na formação de tetrâmeros planares, chamados de G-tétrades, nos quais quatro guaninas interagem através de ligações de hidrogênio Hoogsteen. As tétrades G são empilhadas e posteriormente estabilizadas por cátions monovalentes que são coordenados no centro do núcleo da guanina (Figura 1)¹.

Protocolo

1. Ácido nucleico e preparação de sonda química

1. Ácidos nucleicos
   NOTA: O oligonucleotídeo denominado "TBA" é a sequência de DNA de 15 meros 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3' marcada na extremidade 3' pelo fluoróforo 5-carboxifluoresceína (FAM) para permitir a visualização no gel. O oligonucleotídeo não marcado "cTBA" é sua sequência complementar de DNA 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. A TBA e a CBT são empregadas para a obtenção das três diferentes estruturas, como mostra a Tabela 1.
   1. Ponteiras de autoclave e tubos de 0,5 mL para obtenção de descartáveis estéreis e evitar contaminação.
   2. Preparar soluções-mãe solubilizan....

Discussão

G-quadruplexos são estruturas secundárias de ácidos nucleicos que tipicamente se dobram dentro de sequências de DNA ricas em guanina, e são alvos significativos de pesquisa por causa de sua associação com controle genético e doenças. O mapeamento químico por B-CePs é um protocolo útil para a caracterização do DNA G4s, que pode ser usado para identificar as bases guaninas envolvidas na formação de G-tétrades sob condições fisiológicas salinas.

A sonda química utilizada nest.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide/bis-acrylamide solution 40%	Applichem	A3658	R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS)	Sigma Aldrich	A7460
Analytical balance	Mettler Toledo
Autoclave	pbi international
Boric acid	Sigma Aldrich	B0252
Bromophenol blue Brilliant blue R	Sigma Aldrich	B0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate	Fluka	71649
DMSO	Sigma Aldrich	276855
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	synthesis of custom sequences
EDTA disodium	Sigma Aldrich	E5134
Formamide	Fluka	40248	H351-360D-373
Gel imager	GE Healtcare	STORM B40
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Micro tubes 0.5 mL	Sarstedt	72.704
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Sequencing apparatus	Biometra	Model S2
Silanization solution I	Fluka	85126	H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasic	Carlo Erba	480086
Speedvac concentrator	Thermo Scientific	Savant DNA 120
TEMED	Fluka	87689	R11-21/22-23-34
Tris-HCl	MERCK	1.08387.2500
Urea	Sigma Aldrich	51456
UV-Vis spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 1000