In Vitro G-Quadruplex DNA Yapılarının Bis-3-Kloropiperidinler ile Kimyasal Haritalanması

Özet

Bis-3-kloropipiperidinler (B-CeP'ler), in vitro DNA şablonlarındaki G-dörtlü yapıları tanımlamak ve karakterize etmek için yararlı kimyasal problardır. Bu protokol, B-CeP'ler ile sondalama reaksiyonları gerçekleştirme ve reaksiyon ürünlerini yüksek çözünürlüklü poliakrilamid jel elektroforezi ile çözme prosedürünü detaylandırır.

Özet

G-dörtlüleri (G4'ler), gen ekspresyonu ve hastalıklarda önemli bir rol oynayan ve önemli terapötik hedefleri temsil eden, biyolojik olarak ilgili, kanonik olmayan DNA yapılarıdır. Potansiyel G-dörtlü oluşturan diziler (PQS'ler) içinde DNA'nın in vitro karakterizasyonu için erişilebilir yöntemler gereklidir. B-CeP'ler, nükleik asitlerin yüksek dereceli yapısının araştırılması için yararlı kimyasal problar olduğu kanıtlanmış bir alkilleyici ajan sınıfıdır. Bu makale, guaninlerin N7'si ile B-CeP'lerin spesifik reaktivitesinden yararlanan yeni bir kimyasal haritalama testini ve ardından alkillenmiş Gs'de doğrudan iplik bölünmesini açıklamaktadır.

Yani, G4 kıvrımlarını katlanmamış DNA formlarından ayırt etmek için, G4 düzenlemesini üstlenebilen 15-mer'lik bir DNA olan trombin bağlayıcı aptameri (TBA) araştırmak için B-CeP 1'i kullanıyoruz. B-CeP'ye yanıt veren guaninlerin B-CeP 1 ile reaksiyonu, alkillenmiş guaninlerde tek tek alkilasyon eklentilerini ve DNA zinciri bölünmesini bularak tek nükleotid seviyesinde yüksek çözünürlüklü poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile çözülebilen ürünler verir. B-CeP'leri kullanarak haritalama, G-dörtlü oluşturan DNA dizilerinin in vitro karakterizasyonu için basit ve güçlü bir araçtır ve G-tetradların oluşumunda yer alan guaninlerin kesin konumunu sağlar.

Giriş

Tipik Watson-Crick çift sarmalına ek olarak, nükleik asitler, guanin açısından zengin dizileri nedeniyle alternatif G-dörtlü (G4) formu gibi çeşitli ikincil yapıları benimseyebilir. G4 yapısı, dört guaninin Hoogsteen hidrojen bağları yoluyla etkileşime girdiği G-tetradlar adı verilen düzlemsel tetramerlerin oluşumuna dayanır. G-tetradlar, guanin çekirdeğinin merkezinde koordine edilen monovalent katyonlarla istiflenir ve daha da stabilize edilir (Şekil 1)¹.

Şekil 1: G-dörtlü yapısının şematik gösterimi. (A) Bir G-tetradının şematik gösterimi. Düzlemsel dizi, Hoogsteen baz eşleşmesi ve merkezi bir katyon (M⁺) ile stabilize edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

En az iki ardışık guanin nükleotidinin dört veya daha fazla çalışmasına sahip diziler, G-dörtlü yapılarda katlanabilen potansiyel G-dörtlü oluşturan dizilerdir (PQS'ler). PQS'ler, telomerler, gen promotörleri, ribozomal DNA ve rekombinasyon bölgeleri gibi birçok farklı hücresel bağlamda bulunur ve birçok biyolojik sürecin düzenlenmesinde rol oynar². Bu nedenle, şu anda esas olarak hesaplama araçları aracılığıyla gerçekleştirilen insan genomundaki G4'lerin tanımlanması ve deneysel olarak doğrulanması, biyolojik olarak ilgili bir konudur³. Hesaplamalı tahminleri desteklemek veya öngörülemeyen G4 yapılarını tespit etmek için, bir DNA şablonundaki G4 oluşumunu tanımlamak için kimyasal haritalamaya dayalı erişilebilir bir yöntem burada gösterilmektedir ve G-tetrad yapısını oluşturan guaninlerin kesin olarak tanımlanmasını sağlar.

Rapor edilen kimyasal haritalama testi, G4 yapılarının oluşumunu takiben bis-3-kloropiperidinlerin (B-CeP'ler) guaninlerle farklı reaktivitesinden yararlanır. Nükleofiller ^4,5,6,7,8,9 ile yüksek reaktiviteleri nedeniyle, B-CeP'ler^, guanin nükleotidlerinin¹⁰ N7konumu ile çok verimli bir şekilde reaksiyona girme kabiliyetine sahip nükleik asit-alkilleyici ajanlardır. Alkilasyonu, tek ve çift sarmallı DNA yapılarında depurinasyon ve iplik bölünmesi takip eder. Aksine, G4 düzenlemelerinde G-tetradların oluşumunda yer alan guaninler, guaninlerin N7konumu Hoogsteen hidrojen bağlarında rol oynadığından, B-CeP alkilasyonuna karşı geçirimsizdir. B-CeP'lerin bu spesifik reaktivitesi, yalnızca G4 yapılarının saptanmasına değil, aynı zamanda tetrad(lar)ı oluşturan guaninlerin tanımlanmasına da izin verir, çünkü bunlar, tek ve çift sarmallı DNA'daki guaninlere kıyasla alkilasyondan göreceli korumalarından çıkarılabilir.

Kimyasal haritalama protokolü burada, potasyum katyonları ^11,12 varlığında G4 düzenlemesini üstlenebilen bir ^15-mer DNA olan trombin bağlayıcı aptamerin (TBA) karakterizasyonu için bir prob olarak B-CeP 1 (Şekil 2A) kullanılarak rapor edilmiştir. TBA'nın G4 düzenlemesi (G4-TBA), tek sarmallı formda TBA (ssTBA) ve çift sarmallı yapıyı (dsTBA) oluşturmak için tamamlayıcı dizisine tavlanmış TBA olmak üzere iki kontrol ile doğrudan karşılaştırılır (Tablo 1). Sondalama reaksiyonlarının ürünleri, alkillenmiş guaninlerde tek tek alkilasyon eklentilerini ve DNA zinciri bölünmesini bularak tek nükleotid seviyesinde yüksek çözünürlüklü poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile çözülür. Jel üzerinde görselleştirme, TBA oligonükleotidinin 3' ucunda bir florofor ile konjugasyonu ile sağlanır (Tablo 1). Bu protokol, TBA'nın farklı konformasyonlarında (G4 ve kontroller) nasıl katlanacağını ve B-CeP'ler ve ardından PAGE ile sondalama reaksiyonlarının nasıl gerçekleştirileceğini gösterir.

Protokol

1. Nükleik asit ve kimyasal prob hazırlama

1. Nükleik asitler
   NOT: "TBA" olarak adlandırılan oligonükleotid, jel üzerinde görselleştirmeyi sağlamak için florofor 5-karboksifloresein (FAM) tarafından 3'-ucunda etiketlenen 15-mer DNA dizisi 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3'dür. Etiketlenmemiş oligonükleotid "cTBA", DNA tamamlayıcı dizisi 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'dür. TBA ve cTBA, Tablo 1'de gösterildiği gibi üç farklı yapıyı elde etmek için kullanılır.
   1. Steril tek kullanımlık malzemeler elde etmek ve kontaminasyonu önlemek için otoklav uçları ve 0,5 mL tüpler.
   2. Her oligonükleotidi ultra saf suda 100 μM'lik bir nihai konsantrasyona çözündüren stok çözeltileri hazırlayın. Üretici tarafından sağlanan 260 nm'de sönme katsayısını kullanarak ultraviyole görünür (UV-Vis) spektrofotometre ile tam oligonükleotid konsantrasyonunu belirleyin.
      NOT: Sönme katsayıları: TBA ve cTBA için sırasıyla 164.300 M-1 ^cm-1 ve 138.600 M-1 ^cm-1 kullanılmıştır.
   3. TBA ve cTBA stok çözeltilerini -20 °C'de saklayın (bu koşullarda aylarca).
2. Bileşik B-CeP 1
   NOT: B-CeP 1 bileşiği, daha önce bildirildiği gibi^{sentezlenir 6}.
   1. B-CeP 1 stok çözeltisini ~10 mM'de hazırlayın. Çeker ocakta bulunan analitik bir terazi kullanarak ~1 mg liyofilize bileşiği tartın ve %100 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözündürün.
   2. Kullanılan gerçek bileşik miktarına ve DMSO'ya (d = 1.1 g/^cm3) dayalı olarak tam bileşik konsantrasyonunu hesaplayın.
      NOT: Bileşiği her zaman eldivenlerle kullanın (hem liyofilize edildiğinde hem de DMSO içinde çözündüğünde)^13,14.

Tablo 1: Bu protokolde kullanılan oligonükleotid yapıları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Nükleik asit yapılarının katlanması

1. Tamponların hazırlanması
   1. Bir BPE tampon çözeltisi (bifosfat-etilendiamintetraasetik asit [EDTA], 5x: 2 mM NaH2PO4, 6mM Na2HPO 4, 1 mM_Na2EDTA, pH _7.4) ve ultra saf suda 500 mM KCl'lik bir çözelti hazırlayın. Çözeltileri 0,22 μm gözenek boyutu filtrelerinden geçirin.
      NOT: En iyi sonuçlar için taze hazırlanmış solüsyonlar kullanın. BPE tamponu 4 °C'de 15 güne kadar saklanabilir.
2. G4-TBA, ssTBA ve dsTBA numunelerinin ısıyla yeniden katlama prosedürü ile katlanması
   NOT: G4 yapısını (G4-TBA) katlamak için potasyum katyonları gereklidir. Kontrollerin katlama çözeltisine potasyum katyonları eklemeyin ssTBA ve dsTBA.
   1. 1x BPE ve 100 mM KCl'de 40 μL 4 μM G4-TBA çözeltisi hazırlayın. Tüpü 5 dakika boyunca 95 ° C'ye ısıtarak oligonükleotid G4-TBA çözeltisini denatüre edin ve TBA'nın G-dörtlülerine katlanmasını sağlamak için yavaşça oda sıcaklığına (RT) soğutun.
   2. 1x BPE'de 40 μL 4 μM ssTBA çözeltisi hazırlayın. TBA'yı tek sarmallı formda katlamak için adım 2.2.1'de belirtildiği gibi ısıyla yeniden katlama prosedürünü gerçekleştirin.
   3. 1x BPE'de eşmolar miktarlarda TBA ve cTBA'yı karıştırarak 40 μL'lik 4 μM dsTBA çözeltisi hazırlayın. TBA'nın tamamlayıcı dizisi cTBA'ya tavlanması ve TBA'nın çift sarmallı formunu oluşturması için yukarıda belirtildiği gibi ısıyla yeniden katlama prosedürünü gerçekleştirin (adım 2.2.1).
      NOT: Her bir katlama çözeltisinin nihai hacmi, her bir numune için 5 μL 4 μM çözeltiye ihtiyaç duyulacağı göz önüne alındığında, sondalama reaksiyonları için numune sayısına dayanmaktadır. Pipetleme hatalarını önlemek için her çözeltiden biraz fazla hacim hazırlayın.

3. Reaksiyonların araştırılması

NOT: Sondalama reaksiyonları, ısıyla yeniden katlama prosedüründen hemen sonra yapılmalıdır.

1. G4-TBA, ssTBA ve dsTBA'nın katlama çözeltileri RT'ye soğuduğunda, kısa spinli bir santrifüjleme gerçekleştirin (RT'de 5-8 saniye boyunca 7.000 × g ) ve problama reaksiyonlarını başlatın.
2. 21 adet boş 0,5 mL otoklavlanmış tüp hazırlayın. Bunları, Tablo 2'de bildirildiği gibi, laboratuvar numuneleri için rafta her biri yedi tüpten oluşan üç set halinde düzenleyin.
   NOT: Her sütun seti, G4-TBA, ssTBA ve dsTBA olmak üzere üç farklı TBA katlama koşuluna karşılık gelir. Her sıra üç farklı inkübasyon süresine karşılık gelir. Kolon içindeki her hücre, son B-CeP 1 prob konsantrasyonuna karşılık gelir (Tablo 2). Tüpleri açıkça etiketlediğinizden emin olun.
3. Her tüpe 3 μL ultra saf su ekleyin.
4. İlk setin her tüpüne 5 μL katlanmış G4-TBA ekleyin (adım 3.2). İkinci setin her tüpüne 5 μL katlanmış ssTBA ekleyin. Üçüncü setin her tüpüne 5 μL katlanmış dsTBA ekleyin.
5. B-CeP 1 stok çözeltisini ultra saf suda 250 μM ve 25 μM'ye seyreltin.
   NOT: B-CEP 1 kimyasal probunun dilüsyonları taze olarak hazırlanmalı ve su ile rekabet eden reaksiyonlardan kaçınmak için DNA substratı ile hemen reaksiyona sokulmalıdır.
6. Numunelere 2 μL uygun B-CeP 1 seyreltmesi (25 μM ve 250 μM) ekleyin. Bileşiğin yokluğunda farklı katlanmış TBA'ların analizi için bileşiği üç kontrol numunesinde (C) ultra saf su ile değiştirin. Tüm numuneleri 37 °C'de inkübe edin.
7. 1 saat, 4 saat ve 15 saat inkübasyondan sonra, tüpleri bir sonraki adıma kadar -20 °C'ye yerleştirerek reaksiyonu durdurun.
   NOT: Numuneler bu koşullarda birkaç gün saklanabilir.
8. Numuneleri vakumlu santrifüjde kurutun.
   NOT: Kurutulmuş numuneler, PAGE analizine geçmeden önce -20 °C'de haftalarca saklanabilir.

Tablo 2: Sondalama reaksiyonları için numuneler (yapılar, prob konsantrasyonları ve inkübasyon süresi). Her sütun kümesi, üç farklı TBA katlama koşuluna (G4-TBA, ssTBA ve dsTBA) karşılık gelir. Her sıra üç farklı inkübasyon süresine (1, 4, 15 saat) karşılık gelir. Kolon içindeki her hücre, son B-CeP 1 prob konsantrasyonuna (5 veya 50 μM) karşılık gelir. Her set için kontrol (C), bileşik yokluğunda daha uzun süre (15 saat) inkübe edilen farklı katlanmış TBA'ların bir örneğine karşılık gelir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Yüksek çözünürlüklü SAYFA

1. Denatüre edici poliakrilamid çözeltisinin hazırlanması
   NOT: Önceden 500 mL %20 denatüre edici poliakrilamid jel çözeltisi hazırlayın. Her deney için bu çözeltinin yaklaşık 80 mL'si kullanılacaktır. Çözeltiyi RT'de saklamak için kehribar rengi bir cam şişe kullanın veya bir cam şişeyi alüminyum folyo ile kapatın.
   DİKKAT: Poliakrilamid nörotoksiktir. Jel hazırlama ve dökmenin tüm aşamalarında eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. Polimerize akrilamid'i kontamine malzemeler için uygun bir kutuya atın.
   1. 1 L'lik bir beherde 210 g üre tartın. 250 mL %40 akrilamid/bisakrilamid (19/1) çözeltisi ve 50 mL 10x TBE (890 mM Tris-HCl, 890 mM borat, 20 mM EDTA, pH 8) ekleyin.
   2. Beheri bir karıştırma plakasına yerleştirin ve çözeltiyi bir karıştırma çubuğuyla karıştırın. Sıçramayı ve kirlenmeyi önlemek için karıştırma sırasında kabı alüminyum folyo ile örtün.
   3. Üre tamamen eriyene ve çözelti berraklaşana kadar çözeltiyi karıştırın.
      NOT: Bu adım birkaç saat sürebilir. Ürenin çözünmesini teşvik etmek için, istenen nihai hacmin ötesine geçmeden küçük bir su alikotu ekleyin.
   4. Karıştırma çubuğunu çıkarın. Çözeltiyi bir silindire dökün ve 500 mL'lik kesin bir nihai hacme kadar su ekleyin.
2. Jel aparatının kurulması
   1. İki plakayı (biri çentikli diğeri çentiksiz) %70 etanol ile temizleyin, kurumasını bekleyin ve ardından plakalara bir dimetildiklorosilan çözeltisi uygulayın.
      NOT: Jel sandviç parçalara ayrıldığında jelin plakalardan birinden salınmasına yardımcı olmasına rağmen silanizasyon atlanabilir.
      DİKKAT: Silanizasyon solüsyonunu eldivenlerle tutun ve bu solüsyonla plaka işlemini çeker ocakta gerçekleştirin.
   2. 0.4 mm'lik ara parçaları uzun plakanın uzun kenarları boyunca yerleştirin, kısa plakayı diğerinin üzerine yerleştirin ve iki plakayı alttan hizalayın.
   3. Üst kısım hariç tüm kenarlar boyunca birden fazla kağıt bant katmanı yerleştirin.
   4. Döküm sırasında sızıntıları önlemek için, jelin dibine ek bir bant tabakası ekleyin.
   5. Cam sandviçin kenarlarını temiz kelepçelerle klipsleyin.amptedarikçinin talimatlarını izleyerek (farklı tedarikçiler biraz farklı aparatlar, sandviç kelepçeler ve contalar kullanır).
3. Jeli dökmek
   NOT: Poliakrilamid polimerizasyonu sıcaklığa duyarlı olduğu için jeli RT'de (25 °C) dökün.
   1. Bir behere 80 mL önceden hazırlanmış denatüre edici poliakrilamid çözeltisi (adım 4.1), 450 μL %10 m/V amonyum persülfat (APS) çözeltisi ve 45 μL tetrametiletilendiamin (TEMED) kullanımdan hemen önce dökün.
   2. Çözeltiyi karıştırın ve 50 mL'lik bir şırınga kullanarak cam plakaların arasına hızla dökün. Kabarcıkları önleyerek tarağı cam plakalar arasına istenen sayıda kuyucukla sokun. Gerekirse sandviçi tamamen doldurmak için jel solüsyonu ekleyin. Aşağı bastırmak ve kuyuların eşit dağılımını sağlamak için tarağın üzerine dört kelepçe yerleştirin.
   3. Jelin en az 45 dakika polimerize olmasına izin verin.
4. Jeli çalıştırmak
   1. Polimerizasyondan sonra, tüm kelepçeleri ve kağıt bant katmanlarını çıkarın. Tarağı yavaşça çıkarın ve kuyuları damıtılmış suyla iyice durulayın.
   2. Jel sandviçi dikey jel elektroforez aparatına doğru şekilde yerleştirmek için ilgili tedarikçinin talimatlarını izleyin.
   3. Deiyonize suda TBE çalışma tamponunu (1x: 89 mM Tris-HCl, 89 mM borat, 2 mM EDTA, pH 8) hazırlayın ve hem üst hem de alt rezervuarları tamponla doldurun.
   4. 50 W'ta en az 30 dakika boyunca jel elektroforezinin ön çalışmasını gerçekleştirerek plakaları ısıtın.
   5. Ultra saf suda denatüre edici jel yükleme tamponu (DGLB: 1 M Tris-HCl, %80 formamid, %50 gliserol, %0.05 bromofenol mavisi) hazırlayın.
      NOT: GLB, oligonükleotid numunelerinin jel sistemine hareketinin izlenmesine yardımcı olur ve numunelerin jelin kuyucuklarına yüklenmesine izin verir. Denatüre edici ajan formamidin varlığı, DNA türlerinin denatüre olmayan bir PAGE'de bile boyutlarına göre ayrılmasına izin verir.
   6. Kurutulmuş numuneleri (adım 3.8'deki numuneler) 5 μL DGLB içinde yeniden süspanse edin.
   7. Numuneleri yüklemeden önce, üreyi kuyulardan çıkarmak için küçük bir şırınga ve üst tampon odasındaki TBE tamponunu kullanarak kuyucukları temizleyin.
      NOT: Kuyuları doğru bir şekilde temizlemek için bu adımı birkaç kez tekrarlayın, böylece yorumlanması zor bantlardan kaçının.
   8. Numuneleri temiz kuyulara yükleyin ve yükleme sırasını not edin.
   9. Jel elektroforezini 50 W'ta 2 saat veya en azından bromofenol mavisi boya jelin 2/3'ünü akıtana kadar çalıştırın.
5. Jelin görüntülenmesi
   1. Elektroforezden sonra güç kaynağını kapatın, cam sandviçi çıkarın ve bardakları temizleyin.
   2. Bir jel görüntüleyici kullanarak tarayarak FAM etiketli oligonükleotid bantlarının floresansını tespit edin.

Sonuçlar

Şekil 2, üç farklı yapıda katlanmış TBA oligonükleotidi üzerinde B-CeP 1 ile protokolde açıklandığı gibi, gerçekleştirilen bir kimyasal haritalama testinin temsili bir sonucunu göstermektedir. TBA'nın G-dörtlü düzenlemesi (G4-TBA), oligonükleotidin BPE'de ve K⁺ katyon varlığında katlanmasıyla elde edilirken, aynı TBA dizisinin (ssTBA) tek sarmallı formu potasyum yokluğunda katlandı. Çift sarmallı yapı (dsTBA), TBA'nın BPE tamponundaki tamamlayıc?...

Tartışmalar

G-dörtlüleri, tipik olarak guanin açısından zengin DNA dizileri içinde katlanan nükleik asit ikincil yapılarıdır ve genetik kontrol ve hastalıklarla ilişkileri nedeniyle önemli araştırma hedefleridir. B-CeP'ler ile kimyasal haritalama, fizyolojik tuz koşulları altında G-tetradların oluşumunda rol oynayan guanin bazlarını tanımlamak için kullanılabilen DNA G4'lerin karakterizasyonu için yararlı bir protokoldür.

Bu protokolde kullanılan kimyasal prob, guanin nükleob...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide/bis-acrylamide solution 40%	Applichem	A3658	R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS)	Sigma Aldrich	A7460
Analytical balance	Mettler Toledo
Autoclave	pbi international
Boric acid	Sigma Aldrich	B0252
Bromophenol blue Brilliant blue R	Sigma Aldrich	B0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate	Fluka	71649
DMSO	Sigma Aldrich	276855
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	synthesis of custom sequences
EDTA disodium	Sigma Aldrich	E5134
Formamide	Fluka	40248	H351-360D-373
Gel imager	GE Healtcare	STORM B40
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Micro tubes 0.5 mL	Sarstedt	72.704
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Sequencing apparatus	Biometra	Model S2
Silanization solution I	Fluka	85126	H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasic	Carlo Erba	480086
Speedvac concentrator	Thermo Scientific	Savant DNA 120
TEMED	Fluka	87689	R11-21/22-23-34
Tris-HCl	MERCK	1.08387.2500
Urea	Sigma Aldrich	51456
UV-Vis spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 1000