In Vitro G-Quadruplex DNA Yapılarının Bis-3-Kloropiperidinler ile Kimyasal Haritalanması

Özet

Bis-3-kloropipiperidinler (B-CeP'ler), in vitro DNA şablonlarındaki G-dörtlü yapıları tanımlamak ve karakterize etmek için yararlı kimyasal problardır. Bu protokol, B-CeP'ler ile sondalama reaksiyonları gerçekleştirme ve reaksiyon ürünlerini yüksek çözünürlüklü poliakrilamid jel elektroforezi ile çözme prosedürünü detaylandırır.

Özet

G-dörtlüleri (G4'ler), gen ekspresyonu ve hastalıklarda önemli bir rol oynayan ve önemli terapötik hedefleri temsil eden, biyolojik olarak ilgili, kanonik olmayan DNA yapılarıdır. Potansiyel G-dörtlü oluşturan diziler (PQS'ler) içinde DNA'nın in vitro karakterizasyonu için erişilebilir yöntemler gereklidir. B-CeP'ler, nükleik asitlerin yüksek dereceli yapısının araştırılması için yararlı kimyasal problar olduğu kanıtlanmış bir alkilleyici ajan sınıfıdır. Bu makale, guaninlerin N7'si ile B-CeP'lerin spesifik reaktivitesinden yararlanan yeni bir kimyasal haritalama testini ve ardından alkillenmiş Gs'de doğrudan iplik bölünmesini açıklamaktadır.

Yani, G4 kıvrımlarını katlanmamış DNA formlarından ayırt etmek için, G4 düzenlemesini üstlenebilen 15-mer'lik bir DNA olan trombin bağlayıcı aptameri (TBA) araştırmak için B-CeP 1'i kullanıyoruz. B-CeP'ye yanıt veren guaninlerin B-CeP 1 ile reaksiyonu, alkillenmiş guaninlerde tek tek alkilasyon eklentilerini ve DNA zinciri bölünmesini bularak tek nükleotid seviyesinde yüksek çözünürlüklü poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile çözülebilen ürünler verir. B-CeP'leri kullanarak haritalama, G-dörtlü oluşturan DNA dizilerinin in vitro karakterizasyonu için basit ve güçlü bir araçtır ve G-tetradların oluşumunda yer alan guaninlerin kesin konumunu sağlar.

Giriş

Tipik Watson-Crick çift sarmalına ek olarak, nükleik asitler, guanin açısından zengin dizileri nedeniyle alternatif G-dörtlü (G4) formu gibi çeşitli ikincil yapıları benimseyebilir. G4 yapısı, dört guaninin Hoogsteen hidrojen bağları yoluyla etkileşime girdiği G-tetradlar adı verilen düzlemsel tetramerlerin oluşumuna dayanır. G-tetradlar, guanin çekirdeğinin merkezinde koordine edilen monovalent katyonlarla istiflenir ve daha da stabilize edilir (Şekil 1)¹.

Protokol

1. Nükleik asit ve kimyasal prob hazırlama

1. Nükleik asitler
   NOT: "TBA" olarak adlandırılan oligonükleotid, jel üzerinde görselleştirmeyi sağlamak için florofor 5-karboksifloresein (FAM) tarafından 3'-ucunda etiketlenen 15-mer DNA dizisi 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3'dür. Etiketlenmemiş oligonükleotid "cTBA", DNA tamamlayıcı dizisi 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'dür. TBA ve cTBA, Tablo 1'de gösterildiği gibi üç farklı yapıyı elde etmek için kullanılır.
   1. Steril tek kullanımlık malzemeler elde etmek ve kontaminasyonu önlemek için otoklav uçları ve 0,5 mL tüpler.
   2. Her oligonükleotidi ultra saf suda 100 μM'lik bir nihai ko....

Tartışmalar

G-dörtlüleri, tipik olarak guanin açısından zengin DNA dizileri içinde katlanan nükleik asit ikincil yapılarıdır ve genetik kontrol ve hastalıklarla ilişkileri nedeniyle önemli araştırma hedefleridir. B-CeP'ler ile kimyasal haritalama, fizyolojik tuz koşulları altında G-tetradların oluşumunda rol oynayan guanin bazlarını tanımlamak için kullanılabilen DNA G4'lerin karakterizasyonu için yararlı bir protokoldür.

Bu protokolde kullanılan kimyasal prob, guanin nükleob.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide/bis-acrylamide solution 40%	Applichem	A3658	R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS)	Sigma Aldrich	A7460
Analytical balance	Mettler Toledo
Autoclave	pbi international
Boric acid	Sigma Aldrich	B0252
Bromophenol blue Brilliant blue R	Sigma Aldrich	B0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate	Fluka	71649
DMSO	Sigma Aldrich	276855
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	synthesis of custom sequences
EDTA disodium	Sigma Aldrich	E5134
Formamide	Fluka	40248	H351-360D-373
Gel imager	GE Healtcare	STORM B40
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Micro tubes 0.5 mL	Sarstedt	72.704
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Sequencing apparatus	Biometra	Model S2
Silanization solution I	Fluka	85126	H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasic	Carlo Erba	480086
Speedvac concentrator	Thermo Scientific	Savant DNA 120
TEMED	Fluka	87689	R11-21/22-23-34
Tris-HCl	MERCK	1.08387.2500
Urea	Sigma Aldrich	51456
UV-Vis spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 1000