体外研究双-3-氯哌啶对G-四链体DNA结构的化学定位

摘要

双-3-氯哌啶 （B-CePs） 是有用的化学探针，用于在体外鉴定和表征 DNA 模板中的 G-四链 体结构。该协议详细介绍了用B-CeP进行探测反应和通过高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳分离反应产物的过程。

摘要

G-四链体 （G4s） 是生物学相关的非典型 DNA 结构，在基因表达和疾病中起重要作用，代表重要的治疗靶点。在潜在的 G 四链体形成序列 （PQS） 中对 DNA 进行 体外 表征需要可用的方法。B-CeP是一类烷化剂，已被证明是研究核酸高级结构的有用化学探针。本文描述了一种新的化学定位分析方法，利用 B-CePs 与鸟嘌呤 N7 的特异性反应性，然后在烷基化 Gs 处直接链裂解。

也就是说，为了区分 G4 折叠和未折叠的 DNA 形式，我们使用 B-CeP 1 探测凝血酶结合适配体 （TBA），这是一种能够承担 G4 排列的 15 聚体 DNA。B-CeP 响应鸟嘌呤与 B-CeP 1 的反应产生的产物可以通过高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 在单核苷酸水平上解析，方法是在烷基化鸟嘌呤上定位单个烷基化加合物和 DNA 链切割。使用 B-CePs 进行定位是一种简单而强大的工具，用于体 外 表征 G-四链体形成的 DNA 序列，能够精确定位参与 G-四链体形成的鸟嘌呤。

引言

除了典型的 Watson-Crick 双螺旋结构外，核酸还可以采用各种二级结构，例如替代的 G-四链体 （G4） 形式，因为它们富含鸟嘌呤的序列。G4 结构基于平面四聚体的形成，称为 G-四聚体，其中四个鸟嘌呤通过 Hoogsteen 氢键相互作用。G-四分体通过在鸟嘌呤核心中心配位的一价阳离子堆叠并进一步稳定（图1）¹。

图 1：G 四链体结构的示意图。 （A） G-四联体的示意图。平面阵列通过Hoogsteen碱基配对和中心阳离子（M ⁺）稳定。请点击这里查看此图的较大版本.

研究方案

1.核酸及化学探针制备

1. 核酸
   注：名为“TBA”的寡核苷酸是 15-mer DNA 序列 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-TGG-3'，由荧光基团 5-羧基荧光素 （FAM） 在 3'-末端标记，以实现凝胶上的可视化。未标记的寡核苷酸“cTBA”是其DNA互补序列5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'。采用TBA和cTBA获得三种不同的结构，如 表1所示。
   1. 高压灭菌器吸头和 0.5 mL 试管，以获得无菌一次性用品并避免污染。
   2. 制备将每种寡核苷酸溶解在超纯水中至终浓度为100μM的储备溶液。 使用制造商提供的260nm处的消光系数，使用紫外可见（UV-Vis）分光光度计确定确切的寡核苷酸浓度。
      注：消光系数：TBA 和 cTBA 分别使用 164,300 ^M-1 cm-1 和 138,600 M-1 ^cm-1。
   3. 将TBA和cTBA储备溶液储存在-20°C（在这些条件下储存数月）。
2. 化合物 B-CeP 1
   注：化合物 B-CeP 1 的合成如前所述⁶.
   1. 制备~10mM的B-CeP 1储备溶液。使用位于通风橱中的分析天平称取~1mg冻干化合物，并将其溶解在1....

讨论

G-四链体是核酸二级结构，通常折叠在富含鸟嘌呤的DNA序列中，并且由于它们与遗传控制和疾病有关，因此是重要的研究目标。B-CePs 的化学定位是表征 DNA G4s 的有用方案，可用于鉴定在生理盐条件下参与 G-四分体形成的鸟嘌呤碱基。

该协议中使用的化学探针是B-CeP 1（图2A），其通过与鸟嘌呤核碱基的 N7特异性反应，可以区分参与G-四链体四链体形.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide/bis-acrylamide solution 40%	Applichem	A3658	R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS)	Sigma Aldrich	A7460
Analytical balance	Mettler Toledo
Autoclave	pbi international
Boric acid	Sigma Aldrich	B0252
Bromophenol blue Brilliant blue R	Sigma Aldrich	B0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate	Fluka	71649
DMSO	Sigma Aldrich	276855
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	synthesis of custom sequences
EDTA disodium	Sigma Aldrich	E5134
Formamide	Fluka	40248	H351-360D-373
Gel imager	GE Healtcare	STORM B40
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Micro tubes 0.5 mL	Sarstedt	72.704
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Sequencing apparatus	Biometra	Model S2
Silanization solution I	Fluka	85126	H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasic	Carlo Erba	480086
Speedvac concentrator	Thermo Scientific	Savant DNA 120
TEMED	Fluka	87689	R11-21/22-23-34
Tris-HCl	MERCK	1.08387.2500
Urea	Sigma Aldrich	51456
UV-Vis spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 1000