A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه الورقة طريقة للعزل المغناطيسي القائم على الخرزة للخلايا البطانية للفأر من الشعيرات الدموية اللمفاوية الجلدية. يمكن استخدام الخلايا البطانية اللمفاوية المعزولة في التجارب المختبرية وتحليل التعبير البروتيني.

Abstract

يشارك الجهاز اللمفاوي في تنظيم المراقبة المناعية وامتصاص الدهون وتوازن سوائل الأنسجة. يعد عزل الخلايا البطانية اللمفاوية للفئران عملية مهمة للبحث اللمفاوي ، لأنه يسمح بإجراء التجارب المختبرية والكيميائية الحيوية على الخلايا المعزولة. علاوة على ذلك ، مكن تطوير تقنية Cre-lox من نقص الجينات الخاصة بالأنسجة التي لا يمكن استهدافها عالميا ، مما أدى إلى التحديد الدقيق لدورها في الأنسجة المدروسة. يتطلب تشريح دور جينات معينة في علم وظائف الأعضاء اللمفاوية والفيزيولوجيا المرضية استخدام محفزات خاصة بالغدد الليمفاوية ، وبالتالي التحقق التجريبي من مستويات التعبير عن الجينات المستهدفة.

تمكن طرق العزل الفعال للخلايا البطانية اللمفاوية من الفئران البرية أو المعدلة وراثيا من استخدام المقايسات خارج الجسم الحي وفي المختبر لدراسة الآليات التي تنظم الوظائف اللمفاوية وتحديد مستويات التعبير للبروتينات المدروسة. لقد قمنا بتطوير وتوحيد وتقديم بروتوكول للعزل الفعال للخلايا البطانية اللمفاوية الجلدية (DLECs) عبر تنقية الخرزة المغناطيسية بناء على تعبير LYVE-1. يهدف البروتوكول المحدد إلى تزويد الباحثين بأداة لزيادة فهم وتوضيح اللاعبين المهمين في وظائف الخلايا البطانية اللمفاوية ، خاصة في المرافق التي لا تتوفر فيها معدات فرز الخلايا المنشطة بالفلورة.

Introduction

يلعب الجهاز اللمفاوي دورا محوريا في علم وظائف الأعضاء البشرية. يعتبر عاملا استتبابيا حيويا ، يسهل الوظائف المهمة ، مثل الحفاظ على توازن سائل الأنسجة والبلازما ، والمراقبة المناعية ، وامتصاص الدهون1 ، بالإضافة إلى الوظائف التي تم تحديدها مؤخرا ، مثل قدرة إصلاح القلب2 والقدرة على التجدد للعظام وتكون الدم3. على الرغم من الدور الهام للجهاز اللمفاوي ، إلا أن العديد من جوانب دور الجهاز اللمفاوي ، وكذلك الآليات الجزيئية التي تحكم بعض المعلمات والاستجابات الفسيولوجية لا تزال بعيدة المنال. علاوة على ذلك ، فإن عيوب الأوعية الدموية اللمفاوية تؤدي إلى عوامل أو تتدهور في بعض الحالات الفيزيولوجية المرضية. ومن ا....

Protocol

تم إجراء الدراسات على وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) التابعة لمركز العلوم الصحية بجامعة تكساس للتكنولوجيا (TTUHSC) للتجارب في TTUHSC والإدارة البيطرية لمحافظة غرب اليونان وفقا للتوجيه 2010/63 للتجارب في جامعة باتراس. اتبع بعناية لوائح التخلص من النفايات عند التخلص من النفايات الحيوانية.

1. عزل الأدمة الماوس

  1. اليوم 1
    ملاحظة: في اليوم 1; جهز المواد والمعدات التالية: غرفة التخدير ، ماكينة قص شعر ، الأيزوفلوران ، ملقط ناعم ، مرشحات حقنة 0.2 ميكرومتر.
    1. تحضير محلول ديسباز 2 مجم / مل في DMEM مع 1x محلول مضاد حيوي مضاد للبكتيريا وتعقيمه بالتصفية.
      ملاحظة: يمكن الاستعاضة....

النتائج

تم تطوير الطريقة لتحديد التعبير البروتيني ل GTPase صغير ، RhoA ، تم تخبط الجين المشفر في كلا الأليلات وحذفه تحت تأثير المروج البطاني اللمفاوي المستحث لعقار تاموكسيفين Prox1-CreERT2 18. يمكن استزراع LECs المعزولة لمدة تصل إلى أربعة أجيال ، وبعد ذلك تصبح شيخوخة. لقد تم تجميدها وإذا.......

Discussion

الجهاز اللمفاوي هو منظم مهم لوظيفة الاستتباب في الجسم ، مع أهم الوظائف هي الحفاظ على بلازما السوائل ، وإزالة المنتجات الثانوية الأيضية الخلوية والجزيئات السامة ، وامتصاص الدهون ، والاتجار بالخلايا المناعية1،19. أثار تحديد العلامات المناسبة انفجارا في البي.......

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة اليونانية للبحث والابتكار (00376) ، والمعاهد الوطنية للصحة ، والمعهد الوطني للسرطان (NCI) [منحة R15CA231339] ، ومركز العلوم الصحية بجامعة تكساس للتكنولوجيا (TTUHSC) كلية الصيدلة مكتب منحة العلوم (إلى CMM) ، ومن قبل كلية الصيدلة ، تمويل بدء جامعة لويزيانا مونرو ، المعاهد الوطنية للصحة (NIH) من خلال المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة [Grant P20 GM103424-21] والبرنامج الفرعي للتنافسية البحثية (RCS) التابع لمجلس حكام لويزيانا من خلال صندوق دعم مجلس الحكام (LEQSF (2021-24) -RD-A-23) (إلى GM.). تم الحصول على معدات TTUHSC الشائعة المستخدمة من خلال منح معهد أبحاث الوقاية من السرطان في تكساس (CPRIT) RP190524 و RP200572. لم يكن للممولين أي دور ف....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm Syringe FiltersFisher Scientific09-719C
100 mm Tissue Culture DishesFisher ScientificFB012924
60 mm Tissue Culture DishesFisher ScientificFB012921
Animal Hair ClipperWahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100xFisher Scientific15240-062
Blunt ForcepsFine Science Tools11992-20
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA4919
Cell Strainer 40 μmFisher Scientific542040
Cell Strainer 70 μmFisher Scientific542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat TailCorning354249dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O
Collagenase Type IILife Technologies17101-015
DispaseLife Technologies17105-041
DMEMFisher Scientific11-995-073
DNAse I Solution (2,500 U/mL)Thermo Scientific90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle ConcentratorInvitrogen120-21D
EDTASigma-Aldrich3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium)R&D SystemsCCM027
Euthanasia chamberEuthanex Corporation
Fine ForcepsFine Science Tools11255-20
Fine Scissors-SharpFine Science Tools14060-10
FITC anti-mouse F4/80 AntibodyBiolegend123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic BeadsNew England BiolabsS1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction ChamberEuthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG BeadsThermo Scientific21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBSFisher ScientificAAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1ReliaTech GmbH103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene TubesCorning352063
Syringe Filters w 0.2 μm PoresFisher Scientific09-719C
Trypsin-EDTAFisher Scientific25-300-120

References

  1. Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. The lymphatic vasculature in the 21(st) century: novel functional roles in homeostasis and disease. Cell. 182 (2), 270-296 (2020).
  2. Liu, X., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

LYVE 1 Cre lox

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved