عزل الخلايا البطانية اللمفاوية الجلدية للفأرين

Summary

تصف هذه الورقة طريقة للعزل المغناطيسي القائم على الخرزة للخلايا البطانية للفأر من الشعيرات الدموية اللمفاوية الجلدية. يمكن استخدام الخلايا البطانية اللمفاوية المعزولة في التجارب المختبرية وتحليل التعبير البروتيني.

Abstract

يشارك الجهاز اللمفاوي في تنظيم المراقبة المناعية وامتصاص الدهون وتوازن سوائل الأنسجة. يعد عزل الخلايا البطانية اللمفاوية للفئران عملية مهمة للبحث اللمفاوي ، لأنه يسمح بإجراء التجارب المختبرية والكيميائية الحيوية على الخلايا المعزولة. علاوة على ذلك ، مكن تطوير تقنية Cre-lox من نقص الجينات الخاصة بالأنسجة التي لا يمكن استهدافها عالميا ، مما أدى إلى التحديد الدقيق لدورها في الأنسجة المدروسة. يتطلب تشريح دور جينات معينة في علم وظائف الأعضاء اللمفاوية والفيزيولوجيا المرضية استخدام محفزات خاصة بالغدد الليمفاوية ، وبالتالي التحقق التجريبي من مستويات التعبير عن الجينات المستهدفة.

تمكن طرق العزل الفعال للخلايا البطانية اللمفاوية من الفئران البرية أو المعدلة وراثيا من استخدام المقايسات خارج الجسم الحي وفي المختبر لدراسة الآليات التي تنظم الوظائف اللمفاوية وتحديد مستويات التعبير للبروتينات المدروسة. لقد قمنا بتطوير وتوحيد وتقديم بروتوكول للعزل الفعال للخلايا البطانية اللمفاوية الجلدية (DLECs) عبر تنقية الخرزة المغناطيسية بناء على تعبير LYVE-1. يهدف البروتوكول المحدد إلى تزويد الباحثين بأداة لزيادة فهم وتوضيح اللاعبين المهمين في وظائف الخلايا البطانية اللمفاوية ، خاصة في المرافق التي لا تتوفر فيها معدات فرز الخلايا المنشطة بالفلورة.

Introduction

يلعب الجهاز اللمفاوي دورا محوريا في علم وظائف الأعضاء البشرية. يعتبر عاملا استتبابيا حيويا ، يسهل الوظائف المهمة ، مثل الحفاظ على توازن سائل الأنسجة والبلازما ، والمراقبة المناعية ، وامتصاص الدهون¹ ، بالإضافة إلى الوظائف التي تم تحديدها مؤخرا ، مثل قدرة إصلاح القلب² والقدرة على التجدد للعظام وتكون الدم³. على الرغم من الدور الهام للجهاز اللمفاوي ، إلا أن العديد من جوانب دور الجهاز اللمفاوي ، وكذلك الآليات الجزيئية التي تحكم بعض المعلمات والاستجابات الفسيولوجية لا تزال بعيدة المنال. علاوة على ذلك ، فإن عيوب الأوعية الدموية اللمفاوية تؤدي إلى عوامل أو تتدهور في بعض الحالات الفيزيولوجية المرضية. ومن ا....

Protocol

تم إجراء الدراسات على وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) التابعة لمركز العلوم الصحية بجامعة تكساس للتكنولوجيا (TTUHSC) للتجارب في TTUHSC والإدارة البيطرية لمحافظة غرب اليونان وفقا للتوجيه 2010/63 للتجارب في جامعة باتراس. اتبع بعناية لوائح التخلص من النفايات عند التخلص من النفايات الحيوانية.

1. عزل الأدمة الماوس

1. اليوم 1
   ملاحظة: في اليوم 1; جهز المواد والمعدات التالية: غرفة التخدير ، ماكينة قص شعر ، الأيزوفلوران ، ملقط ناعم ، مرشحات حقنة 0.2 ميكرومتر.
   1. تحضير محلول ديسباز 2 مجم / مل في DMEM مع 1x محلول مضاد حيوي مضاد للبكتيريا وتعقيمه بالتصفية.
      ملاحظة: يمكن الاستعاضة....

النتائج

تم تطوير الطريقة لتحديد التعبير البروتيني ل GTPase صغير ، RhoA ، تم تخبط الجين المشفر في كلا الأليلات وحذفه تحت تأثير المروج البطاني اللمفاوي المستحث لعقار تاموكسيفين Prox1-CreER^{T2 18}. يمكن استزراع LECs المعزولة لمدة تصل إلى أربعة أجيال ، وبعد ذلك تصبح شيخوخة. لقد تم تجميدها وإذا.......

Discussion

الجهاز اللمفاوي هو منظم مهم لوظيفة الاستتباب في الجسم ، مع أهم الوظائف هي الحفاظ على بلازما السوائل ، وإزالة المنتجات الثانوية الأيضية الخلوية والجزيئات السامة ، وامتصاص الدهون ، والاتجار بالخلايا المناعية^1،19. أثار تحديد العلامات المناسبة انفجارا في البي.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Syringe Filters	Fisher Scientific	09-719C
100 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012924
60 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012921
Animal Hair Clipper	Wahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100x	Fisher Scientific	15240-062
Blunt Forceps	Fine Science Tools	11992-20
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4919
Cell Strainer 40 μm	Fisher Scientific	542040
Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat Tail	Corning	354249	dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O
Collagenase Type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM	Fisher Scientific	11-995-073
DNAse I Solution (2,500 U/mL)	Thermo Scientific	90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator	Invitrogen	120-21D
EDTA	Sigma-Aldrich	3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium)	R&D Systems	CCM027
Euthanasia chamber	Euthanex Corporation
Fine Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Fine Scissors-Sharp	Fine Science Tools	14060-10
FITC anti-mouse F4/80 Antibody	Biolegend	123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads	New England Biolabs	S1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber	Euthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads	Thermo Scientific	21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS	Fisher Scientific	AAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	SH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1	ReliaTech GmbH	103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene Tubes	Corning	352063
Syringe Filters w 0.2 μm Pores	Fisher Scientific	09-719C
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25-300-120