Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه الورقة طريقة للعزل المغناطيسي القائم على الخرزة للخلايا البطانية للفأر من الشعيرات الدموية اللمفاوية الجلدية. يمكن استخدام الخلايا البطانية اللمفاوية المعزولة في التجارب المختبرية وتحليل التعبير البروتيني.

Abstract

يشارك الجهاز اللمفاوي في تنظيم المراقبة المناعية وامتصاص الدهون وتوازن سوائل الأنسجة. يعد عزل الخلايا البطانية اللمفاوية للفئران عملية مهمة للبحث اللمفاوي ، لأنه يسمح بإجراء التجارب المختبرية والكيميائية الحيوية على الخلايا المعزولة. علاوة على ذلك ، مكن تطوير تقنية Cre-lox من نقص الجينات الخاصة بالأنسجة التي لا يمكن استهدافها عالميا ، مما أدى إلى التحديد الدقيق لدورها في الأنسجة المدروسة. يتطلب تشريح دور جينات معينة في علم وظائف الأعضاء اللمفاوية والفيزيولوجيا المرضية استخدام محفزات خاصة بالغدد الليمفاوية ، وبالتالي التحقق التجريبي من مستويات التعبير عن الجينات المستهدفة.

تمكن طرق العزل الفعال للخلايا البطانية اللمفاوية من الفئران البرية أو المعدلة وراثيا من استخدام المقايسات خارج الجسم الحي وفي المختبر لدراسة الآليات التي تنظم الوظائف اللمفاوية وتحديد مستويات التعبير للبروتينات المدروسة. لقد قمنا بتطوير وتوحيد وتقديم بروتوكول للعزل الفعال للخلايا البطانية اللمفاوية الجلدية (DLECs) عبر تنقية الخرزة المغناطيسية بناء على تعبير LYVE-1. يهدف البروتوكول المحدد إلى تزويد الباحثين بأداة لزيادة فهم وتوضيح اللاعبين المهمين في وظائف الخلايا البطانية اللمفاوية ، خاصة في المرافق التي لا تتوفر فيها معدات فرز الخلايا المنشطة بالفلورة.

Introduction

يلعب الجهاز اللمفاوي دورا محوريا في علم وظائف الأعضاء البشرية. يعتبر عاملا استتبابيا حيويا ، يسهل الوظائف المهمة ، مثل الحفاظ على توازن سائل الأنسجة والبلازما ، والمراقبة المناعية ، وامتصاص الدهون1 ، بالإضافة إلى الوظائف التي تم تحديدها مؤخرا ، مثل قدرة إصلاح القلب2 والقدرة على التجدد للعظام وتكون الدم3. على الرغم من الدور الهام للجهاز اللمفاوي ، إلا أن العديد من جوانب دور الجهاز اللمفاوي ، وكذلك الآليات الجزيئية التي تحكم بعض المعلمات والاستجابات الفسيولوجية لا تزال بعيدة المنال. علاوة على ذلك ، فإن عيوب الأوعية الدموية اللمفاوية تؤدي إلى عوامل أو تتدهور في بعض الحالات الفيزيولوجية المرضية. ومن الأمثلة المعروفة هي الوذمة اللمفية الأولية والثانوية ، اعتمادا على الأصل الجيني أو غير الوراثي للمرض ، على التوالي ، في حين أن دور الجهاز اللمفاوي في نمو الورم الأولي وانتشاره النقيلي محوري ، حيث يمكن أن يكون بمثابة قناة للورم الخبيث ومعدل وظائف المناعة1.

يرجع التأخر في دراسة ومعرفة الجهاز اللمفاوي مقارنة بالأوعية الدموية إلى الاكتشاف اللاحق للجهاز اللمفاوي مقارنة بنظام الأوعية الدموية في الدم والتأخير في تحديد العلامات الجزيئية الخاصة باللمفاوية. وقد تحسن هذا بشكل كبير في العقود الأخيرة ، مما أدى إلى تغيير الصورة التقليدية لللمفاويات في حالة مستقرة وفي ظروف مرضية1. على غرار تكوين الأوعية الدموية ، فإن تكوين الأوعية اللمفاوية هو تكوين أوعية لمفاوية جديدة من الأوعية الموجودة مسبقا ويلعب دورا محوريا في تطوير مجموعة واسعة من الأمراض4،5،6. ومع ذلك ، على عكس تكوين الأوعية الدموية ، اقتصر التحقيق في تكوين الأوعية اللمفاوية على نماذج الجسم الحي في الغالب التي تركز على تكوين الأوعية الدموية التنموية والعيوب الهيكلية في النماذج المرضية. يعد عزل الخلايا البطانية اللمفاوية أمرا مهما للدراسات في المختبر ، ويمكن توفير ذلك من خلال البروتوكول المقدم.

تم تطوير العديد من البروتوكولات لعزل البطانة اللمفاوية من الفئران ، والتي تتطلب استخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورة7. ميزة فارز الخلايا ، حيثما كان ذلك متاحا ، هي درجة أعلى من النقاء ، على عكس العزلة القائمة على الخرز ، حيث يوفر الأخير عائدا أعلى. يستخدم البروتوكول التعبير عن مستقبلات الهيالورونان البطانية اللمفاوية 1 (LYVE-1) ، وهي علامة بطانية لمفاوية ، مهمة لتهريب الخلايا داخل الأوعية اللمفاوية 4,8. نظرا لأن تعبير LYVE-1 يقتصر على الشعيرات الدموية اللمفاوية وليس الأوعية اللمفاوية المجمعة ، فإن هذه التقنية مناسبة لعزل الخلايا البطانية اللمفاوية على وجه التحديد من الشعيرات الدموية اللمفاوية ، على عكس العلامات اللمفاوية الأخرى ، مثل podoplanin ، والتي يتم التعبير عنها بشكل موحد في جميع الخلايا البطانية اللمفاوية9. بالنسبة للبروتوكول ، تم استبعاد العلامات اللمفاوية المهمة الأخرى التي لم تكن عبر الغشاء ، مثل Prox1.

نظرا لأن النتيجة الفسيولوجية كانت تكوين الأوعية اللمفاوية ، والتي تبدأ عادة في الشعيرات الدموية اللمفاوية ، فقد تم اختيار LYVE-1 كهدف بسبب انتقائيته في هذه الخلايا ولأن الجسم المضاد المختار قدم عائدا مرتفعا. كانت الإنزيمات المستخدمة هي الكولاجين من النوع الثاني ، والذي يعرف عموما أنه أكثر فعالية في تفكك الكولاجين من النوع الأول10 ، و dispase ، وهو بروتياز أوسع ، يستخدم بانتظام لفصل الأدمةوالبشرة 11. ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن إنزيمات أخرى لفصل الأنسجة 12,13 ويمكن استخدامها. الهدف من هذا البروتوكول هو وصف طريقة لعزل الخلايا البطانية اللمفاوية الجلدية من الشعيرات الدموية اللمفاوية للفئران البالغة ذات الغلة العالية باستخدام تنقية الخرزة المغناطيسية ، خاصة في الأماكن التي لا يتوفر فيها فرز الخلايا المنشط بالفلورة بسهولة. هذه الطريقة مناسبة للتطبيقات التي يمكن فيها اختراق نقاء الخلايا البطانية اللمفاوية للتطبيقات النهائية.

Protocol

تم إجراء الدراسات على وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) التابعة لمركز العلوم الصحية بجامعة تكساس للتكنولوجيا (TTUHSC) للتجارب في TTUHSC والإدارة البيطرية لمحافظة غرب اليونان وفقا للتوجيه 2010/63 للتجارب في جامعة باتراس. اتبع بعناية لوائح التخلص من النفايات عند التخلص من النفايات الحيوانية.

1. عزل الأدمة الماوس

  1. اليوم 1
    ملاحظة: في اليوم 1; جهز المواد والمعدات التالية: غرفة التخدير ، ماكينة قص شعر ، الأيزوفلوران ، ملقط ناعم ، مرشحات حقنة 0.2 ميكرومتر.
    1. تحضير محلول ديسباز 2 مجم / مل في DMEM مع 1x محلول مضاد حيوي مضاد للبكتيريا وتعقيمه بالتصفية.
      ملاحظة: يمكن الاستعاضة عن استخدام الوسط أو PBS ب HBSS ، حيث تم استخدامه بنجاح في البروتوكولات الأخرى المبلغ عنها12. يمكن استبدال محلول 1x مضاد حيوي مضاد حيوي بإضافة البنسلين (100 وحدة دولية / مل) ، والستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) ، والأمفوتريسين (2.5 ميكروغرام / مل).
    2. تخدير الفأر عن طريق وضع الفأر في غرفة التخدير مع إعطاء إيزوفلوران (0.5-2٪ إيزوفلوران ، تدفق: 1 لتر / دقيقة). بعد توقف الماوس عن الحركة ، قم بنقله خارج القفص ، واستمر في التخدير بضبط مخروط الأنف بتدفق إيزوفلوران مماثل. قم بقرص لتأكيد مستويات التخدير الكافية ومراقبة الماوس باستمرار لضمان الحفاظ على التخدير العميق (بدون حركة). قص حوالي 9 سم2 من الفراء الظهري والبطني (ظهر الفأر والبطن على التوالي) طوليا على طول خط الوسط ، باستخدام ماكينة قص الشعر. دع الماوس يتعافى من التخدير ويعيده إلى القفص.
      ملاحظة: يمكن استخدام كريم إزالة الشعر (إزالة الشعر) بدلا من ذلك. تأكد من إزالة الفراء تماما في مناطق الجلد المراد عزلها مع الحفاظ على سلامة الجلد. حاول قص منطقة الجلد الممتدة قدر الإمكان. لضمان حل الالتهاب المحتمل الناتج عن إزالة الشعر ، يجب أن يتم عزل الخلايا في اليوم التالي. لزيادة عدد الخلايا المعزولة تجمع 2 إلى 4 فئران لكل مجموعة.
  2. اليوم 2
    ملاحظة: احتفظ بالمواد والمعدات التالية جاهزة: غرفة القتل الرحيم ، خزانة السلامة الحيوية ، حاضنة CO2 ، الإيثانول ، المقص الناعم ، الملقط الدقيق ، الملقط الحاد ، لوحة زراعة الأنسجة 100 مم ، Dispase ، DMEM ، 1x محلول مضاد حيوي مضاد للفطريات.
    1. القتل الرحيم للماوس عن طريق إدارة CO2 ووضعه في وضع ضعيف ، وفضح المنطقة المقطوعة. رش 70 ٪ من الإيثانول كمطهر.
      ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، يجب تنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف معقمة (في خزانة السلامة البيولوجية).
    2. ضع صفيحة زراعة الأنسجة المعقمة مقاس 100 مم على الثلج.
    3. قم بعمل قطع سطحي 0.5 بوصة في البطن وقطعه طوليا على طول خط الوسط إلى الرقبة وأسفل البطن. قم بعمل جروح جانبية لتكون قادرة على فتح الجلد.
      ملاحظة: يعتمد حجم الشق ومنطقة الجلد المعزولة على حجم الماوس.
    4. باستخدام ملقط حاد ، افصل الجلد بعناية عن الأنسجة المحيطة. افعل ذلك حول جذع الماوس بالكامل ، وقطع الجلد بشكل جانبي حول الرقبة وأسفل البطن.
    5. ضع الجلد بعناية في لوحة زراعة الأنسجة مقاس 100 مم ، مع توجيه جانب الأدمة لأسفل ، مع الحفاظ على تمدد الجلد قدر الإمكان. قم بتغطية الأطباق واحتفظ بها على الجليد. أكمل عزل جميع الفئران من المجموعة.
    6. بعد استخراج الجلد من جميع الفئران ، احتضان الألواح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتسطيح الزرع.
    7. أضف 6 مل من محلول Dispase إلى اللوحة ، مع التأكد من غمر الجلد تماما واحتضانه طوال الليل مع التقليب الخفيف عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: بدلا من Dispase ، يمكن أيضا إجراء هضم التربسين12 ، يليه Liberase بدلا من علاج Collagenase من النوع الثاني (أدناه).

2. عزل الخلايا من الأدمة

  1. اليوم 3
    ملاحظة: احتفظ بالمواد والمعدات التالية جاهزة: أجهزة الطرد المركزي ، حاضنة CO2 ، خزانة السلامة الحيوية ، المقص ، DMEM ، 1x محلول مضاد حيوي مضاد حيوي ، كولاجيناز من النوع الثاني ، PBS ، أنبوب مخروطي 50 مل ، ألواح زراعة الأنسجة 100 مم و 60 مم ، محلول DNAse I ، الكولاجين من النوع الأول ، مصافي الخلايا 70 ميكرومتر و 40 ميكرومتر ، مرشحات حقنة 0.2 ميكرومتر ، وسط LEC.
    1. تحضير 500 مل من 1x PBS (1.37 M NaCl ، 27 mM KCl ، 100 mM Na2HPO4 ، 18 mM KH2PO4 ، pH 7.4) والأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة عند 15 رطل لكل بوصة مربعة أو تعقيم المرشح. بدلا من ذلك ، استخدم برنامج تلفزيوني معقم متاح تجاريا.
    2. تحضير 10 مل من محلول كولاجيناز من النوع الثاني 2 مجم / مل في DMEM مع 1x محلول مضاد حيوي مضاد للبكتيريا وتعقيمه بالتصفية.
      ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات التالية تحت غطاء معقم لتقليل فرص تلوث العينة.
    3. استخدم ماصة لإزالة السائل من الطبق.
    4. استخدم الملقط لفصل الأدمة (أسفل الجلد) عن البشرة (أعلى) وإزالة أي أنسجة دهنية واضحة. نقل الأدمة إلى لوحة زراعة الأنسجة نظيفة.
    5. أضف 1 مل من DMEM مع 1x محلول مضاد حيوي مضاد حيوي في لوحة زراعة الأنسجة النظيفة وقم بإمالتها بحيث يتراكم السائل على جانب واحد من اللوحة.
    6. فرم الأدمة إلى 1-2 مم2 قطعة ونقلها إلى أنبوب مخروطي جديد 50 مل.
      ملاحظة: يجب إكمال هذه الخطوة بشكل مثالي في غضون 4-5 دقائق ، حيث لا يتوقع أن توفر المعالجة الأطول إنتاجية أعلى أو بقاء الخلية.
    7. أضف 10 مل من محلول كولاجيناز من النوع الثاني.
    8. أضف 50 ميكرولتر (25 وحدة / مل من المحلول) من محلول DNAse I (يقلل من تكتل الخلايا) وهضم محلول الأدمة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية مع التقليب المستمر (استخدم حاضنة دوارة / اهتزاز عند 30-50 دورة في الدقيقة).
      ملاحظة: تحقق بشكل دوري لتحديد ما إذا كان قد تم هضم معظم الأدمة. إذا لم يكن كذلك ، قم بزيادة وقت الهضم (1 ساعة إضافية كحد أقصى) وسرعة التحريض ، إن أمكن.
    9. قم بتغطية ألواح زراعة الأنسجة مقاس 60 مم ب 2 مل من الكولاجين من النوع الأول سعة 10 ميكروغرام / مل في 0.02 متر من حمض الخليك لمدة >20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اغسل 2x مع برنامج تلفزيوني معقم.
    10. قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة خلية 70 ميكرومتر وأجهزة طرد مركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
    11. أعد التعليق في 10 مل من DMEM باستخدام 1x محلول مضاد حيوي ومضاد للفطريات.
    12. قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر وأجهزة طرد مركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
    13. يعاد التعليق في 1 مل من وسائط LEC الكاملة (وسط قاعدة نمو الخلايا البطانية مع الملحق).
    14. قم بطلاء الخلايا في لوحة زراعة الأنسجة المغلفة بالكولاجين مقاس 60 مم في وسائط LEC كاملة. سيكون هذا هو اليوم 0 من ثقافة الخلية.
    15. استبدل الوسائط بعد كل يومين عن طريق غسل الخلايا ب 1x PBS مرتين وإضافة وسائط LEC جديدة.
    16. كرر الخطوة 2.1.15 حتى تتلاقى الخلايا بنسبة 80-90٪.
      ملاحظة: إذا تم إجراء التنقية قبل أن تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80-90٪ ، عزل عدد أقل من الخلايا البطانية اللمفاوية. تستغرق هذه العملية حوالي 7 إلى 10 أيام.

3. طلاء حبة مغناطيسية مع الأجسام المضادة LYVE-1

ملاحظة: قبل يوم واحد من خطوة التنقية ، جهز المواد والمعدات التالية: ثلاجة 4 درجات مئوية ، دوار ، فاصل مغناطيسي ، PBS ، خرز مغناطيسي مضاد للأرانب IgG ، أنابيب طرد مركزي دقيقة ، مرشحات حقنة 0.2 ميكرومتر ، محلول طلاء حبة مغناطيسية ، جسم مضاد LYVE-1.

  1. تحضير محلول طلاء الخرزة المغناطيسية: 20 مل من PBS مع 0.1٪ BSA و 2 mM EDTA وتعقيمه بالتصفية. احفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: لا ينصح بأكثر من بضعة أيام من التخزين ؛ تحقق من وجود رواسب أو تلوث قبل الاستخدام.
  2. ماصة 500 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي IgG المضاد للأرانب إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وإضافة 1 مل من محلول طلاء الخرزة المغناطيسية المثلجة.
  3. استخدم فاصلا مغناطيسيا لغسل الخرز.
  4. كرر الغسلات 2x مع 1 مل من محلول طلاء الخرزة المغناطيسية المثلجة.
  5. أعد تعليق الخرز في 500 ميكرولتر من محلول طلاء الخرزة المغناطيسية وقم بعمل حصص 150 ميكرولتر في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.
  6. أضف 15 ميكروغرام من الجسم المضاد LYVE-1 إلى كل أنبوب (15 ميكرولتر من تركيز مخزون الأجسام المضادة 1 مجم / مل).
  7. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع التقليب المستمر.

4. تنقية الخلايا البطانية اللمفاوية

ملاحظة: جهز المواد والمعدات التالية: حاضنة CO2 ، شاكر ، مؤقت ، بارافيلم ، DMEM ، 1x محلول مضاد حيوي مضاد للفطريات ، BSA ، PBS ، محلول طلاء حبة مغناطيسية ، تربسين-EDTA ، ألواح زراعة الأنسجة 100 مم أو 60 مم ، مرشحات حقنة 0.2 ميكرومتر ، الكولاجين من النوع الأول ، حمض الخليك ، وسط LEC.

  1. تحضير 50 مل من DMEM مع 1x محلول مضاد حيوي مضاد حيوي و 0.1٪ BSA وتعقيمه بالتصفية.
  2. قم بتغطية ألواح زراعة الأنسجة 60 مم ب 10 ميكروغرام / مل من الكولاجين من النوع الأول في 0.02 م حمض الخليك لمدة >20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اغسل 2x مع برنامج تلفزيوني معقم.
  3. اغسل الخرزات المطلية مسبقا ب 1 مل من محلول طلاء الخرزة المغناطيسية باستخدام فاصل مغناطيسي.
  4. أعد تعليق الخرز في 150 ميكرولتر من DMEM مع 0.1٪ BSA.
    ملاحظة: يمكن الآن تخزين الخرز في 4 °C لمدة تصل إلى 1 شهر.
  5. اغسل الخلايا 2x باستخدام برنامج تلفزيوني.
  6. أضف 3 مل من DMEM مع 0.1٪ BSA (للوحة زراعة الأنسجة 60 مم) و 50 ميكرولتر من الخرز المترافق بالأجسام المضادة إلى الخلايا.
    ملاحظة: إذا تم تجميع خلايا اثنين أو أكثر من الفئران ، فاستخدم صفيحة زراعة الأنسجة 100 مم وأضف 6 مل من DMEM مع 0.1٪ BSA.
  7. ختم الطبق مع parafilm.
  8. ضع الطبق على شاكر مع التقليب عند 10 دورات في الدقيقة في RT واحتضانه لمدة 10 دقائق بالضبط.
    ملاحظة: الحضانة الأطول ستؤدي إلى ربط غير محدد. للتأكد من تفاعل الخرزات مع سطح اللوحة بالكامل ، قم بتدوير اللوحة يدويا بعد كل بضع دقائق مع استمرارها في الاهتزاز.
  9. تخلص من الوسط واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني. افحص الخلايا بسرعة للتحقق من وجود مستعمرات LEC على اللوحة.
  10. التربسين الخلايا: استخدم 1 مل من التربسين-EDTA واحتضانها لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية. افحص الخلايا بحثا عن انفصال ناجح للخلايا.
  11. قم بتحييد المحلول ب 2 مل من وسائط LEC الكاملة وانقل المحلول إلى أنبوب بولي بروبيلين معقم سعة 5 مل.
  12. باستخدام فاصل مغناطيسي ، اغسل الخلايا 4 × 3 مل من DMEM مع 0.1٪ BSA لإزالة الخلايا غير المنضمة.
  13. أعد تعليق الخلايا المتبقية المرتبطة بالخرز في وسائط LEC كاملة ولوحة على ألواح زراعة الأنسجة 60 مم المطلية بالكولاجين سابقا.
  14. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية وقم بتغيير الوسائط كل يومين بعد غسلتين PBS في كل مرة.
  15. استزراع الخلايا حتى تصل إلى نقطة التقاء (يستغرق الأمر عادة من 7 إلى 10 أيام).
  16. في هذه المرحلة ، تحقق من الخلايا الموجودة تحت المجهر بحثا عن الالتقاء وتابع إعداد الخلايا لقياس التدفق الخلوي. إذا تم تحديد نسبة F4 / 80+ عالية ، فكرر خطوة التنقية باستخدام LYVE-1 (الخطوة 4: تنقية الخلايا البطانية اللمفاوية) مرة أخرى أو من الناحية المثالية علامة لمفاوية أخرى (مثل podoplanin14).
    ملاحظة: تم إثبات التعبير العالي للبروتين الذي يستهدفه الجسم المضاد على عدد الخلايا المنقاة بالخرز المغناطيسي15,16. ومع ذلك ، بالنسبة ل LYVE-1 ، من المهم إجراء التحكم في قياس التدفق الخلوي لتحديد النسبة المئوية لخلايا LYVE-1 + الأخرى ، ومعظمها من البلاعم. يتم التعبير عن LYVE-1 فقط في مجموعات فرعية من الضامة المرتبطة بالأورام والجروح ، بينما في الجلد السليم ، يقتصر تعبير LYVE-1 على الخلايا البطانية اللمفاوية17. وبالتالي ، فإن فحص F4 / 80 ليس إلزاميا ، ولكنه يعتمد على السياق التجريبي. لم تحمل الفئران المستخدمة في العرض التوضيحي أوراما أو جروحا ، فقط التهابا محتملا من إزالة الشعر ، لكننا قمنا بتضمين تلطيخ F4 / 80 كخط أساس للنسبة المئوية لبلاعم LYVE-1 +.

5. قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: جهز المواد والمعدات التالية: أجهزة الطرد المركزي ، حاضنة CO2 ، المؤقت ، مقياس الدم ، محلول EDTA ، 1x محلول مضاد حيوي مضاد حيوي ، BSA ، PBS ، تربسين-EDTA ، أنابيب البولي بروبلين ، مرشحات حقنة 0.2 ميكرومتر ، 70٪ إيثانول ، F4 / 80 جسم مضاد مقترن FITC.

  1. قم بإعداد برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ BSA وقم بتعقيمه بالتصفية.
  2. قم بإعداد محلول 1 mM EDTA في برنامج تلفزيوني.
  3. التربسين الخلايا: احتضان الخلايا ب 1 مل من محلول EDTA 1 مللي متر لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: الحضانة بمحلول EDTA هي طريقة أكثر اعتدالا لانفصال الخلايا ، والتي تحافظ بشكل أفضل على البروتينات عبر الغشاء ويفضل ، ولكنها تتطلب فترات حضانة أطول. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام محلول التربسين-EDTA لمدة 1 دقيقة حضانة عند 37 درجة مئوية ، ولكن هذا يمكن أن يؤثر على تقارب الأجسام المضادة لتطبيقات قياس التدفق الخلوي.
  4. قم بتحييد المحلول ب 2 مل من وسائط LEC الكاملة وانقل المحلول إلى أنبوب بولي بروبيلين معقم سعة 5 مل.
  5. أجهزة الطرد المركزي العينات في 250 × غرام لمدة 5 دقائق.
  6. يغسل مع برنامج تلفزيوني.
  7. كرر الطرد المركزي وغسل PBS.
  8. أعد تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ BSA وعدها باستخدام مقياس الدم أو طريقة بديلة. القسمة ~ 1 × 106 خلايا في أنابيب البولي بروبلين مع حجم نهائي من 100 ميكرولتر. من هذه الخطوة فصاعدا ، قم بتنفيذ جميع الخطوات عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن تثبيت الخلايا قبل تلطيخها أو تلطيخها وهي على قيد الحياة. يمكن أن يكون التثبيت دون المستوى الأمثل لقياس التدفق الخلوي ، حيث قد لا تكتشف بعض الأجسام المضادة المستضدات بعد التثبيت ؛ لذلك ، نوصي بتشغيل قياس التدفق الخلوي مباشرة بعد الخطوة السابقة وتخطي خطوة التثبيت. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، فإن التثبيت قبل تجربة قياس التدفق الخلوي سيسمح بتأخير خطوة قياس التدفق الخلوي. إذا كان سيتم إجراء التثبيت ، فيجب تقييم أداء الأجسام المضادة في سياق الخلايا الثابتة مسبقا.
  9. قم بإجراء التثبيت (خطوة اختيارية ؛ إذا لم يتم إصلاح الخلايا ، فتابع التلوين المناعي): أعد تعليق الخلايا في الإيثانول المثلج بنسبة 70٪ واخلطها برفق لمدة 10 دقائق على الثلج.
    ملاحظة: تثبيت الإيثانول يمكن أن يتخلل الخلايا ويؤدي إلى إطلاق GFP ؛ ومع ذلك ، يمكن للتثبيت القائم على بارافورمالدهايد أن يدمر الأصباغ المستخدمة في قياس التدفق الخلوي ويمكن تجنبه بشكل مثالي.
  10. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  11. اغسل الخلايا 2x عن طريق الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق في 1x PBS.
  12. انتقل إلى الخطوة التالية أو أعد تعليق الخلايا في 0.5-1 مل من 1x PBS وتخزينها في 4 درجات مئوية.

6. التلوين المناعي

ملاحظة: تعامل مع الخلايا برفق وتجنب السحب المكثف ، عندما يكون ذلك ممكنا ، للحفاظ على سلامة غشاء الخلية وتقليل موت الخلايا ، مما يضمن أن الخلايا لا تشكل كتل. من الخلايا البطانية المعزولة ، قم بإعداد المجموعات التالية: الخلايا غير الملوثة والخلايا الملطخة بعلامة خلية بطانية أخرى (مثل VEGFR3 ، podoplanin) ، F4 / 80 ، وكليهما. قم بتضمين الخلايا البطانية اللمفاوية للفأر المتاحة تجاريا والبلاعم ، إذا كانت متوفرة ، كعناصر تحكم إيجابية. لأغراض العرض التوضيحي ، وبسبب مضان tdTomato الداخلي (PE +) ، استخدمنا تلطيخ F4 / 80 المترافق FITC.

  1. تمييع الجسم المضاد الأساسي في PBS مع 0.1٪ BSA وفقا للتخفيف الموصى به أو الأمثل. أضف 0.5 ميكروغرام (1 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة) من الجسم المضاد المترافق F4 / 80 FITC إلى 100 ميكرولتر من معلق الخلية.
  2. إعادة تعليق الخلايا بعد إضافة الجسم المضاد الفلوري المخفف. امزج عن طريق تحريك أنبوب البولي بروبلين للتأكد من عدم وجود كتل وأن جميع الخلايا مغلفة بشكل صحيح.
  3. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (الخلايا الثابتة) أو 30 دقيقة على الجليد (الخلايا الحية) في الظلام.
  4. اغسل الخلايا 2x عن طريق الطرد المركزي لها عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية (للخلايا الحية) أو في درجة حرارة الغرفة (للخلايا الثابتة) ، باستخدام PBS مع 0.1٪ BSA في الظلام.
  5. للأجسام المضادة غير المقترنة بالفلورسنت
    1. تمييع الجسم المضاد الثانوي الفلوروكروم في المخزن المؤقت للحضانة. بالنسبة للأجسام المضادة لدقيق Alexa ، استخدم تخفيفا بنسبة 1: 500.
    2. أضف الجسم المضاد الثانوي إلى 100 ميكرولتر من محلول تعليق الخلية.
    3. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (الخلايا الثابتة) أو على الجليد (الخلايا الحية).
    4. يغسل مرتين بالطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية (للخلايا الحية) أو في درجة حرارة الغرفة (للخلايا الثابتة) في مخزن الحضانة.
  6. أعد تعليق الخلايا في 0.5 مل من 1x PBS وقم بتحليلها باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
  7. اتبع خطوات استراتيجية البوابة هذه لتحديد عدد البلاعم داخل الخلايا المعبرة عن LYVE-1:
    1. ضع في اعتبارك التشتت الأمامي والجانبي لتمييز المجتمع الخلوي.
    2. ضع في اعتبارك التشتت الأمامي لمنطقة حجم الخلية وارتفاعها لتمييز الخلايا المفردة (Singlets).
    3. ضع في اعتبارك تعبير F4 / 80 (FITC) وتعبير RFP (PE) لتحديد البلاعم (F4 / 80+) داخل خلايا الفئران المعزولة التي تعبر عن tdTomato (PE) (بسبب وجود مراسل tdTomato الفلوري في الفئران المحددة ، الموضحة أدناه).

النتائج

تم تطوير الطريقة لتحديد التعبير البروتيني ل GTPase صغير ، RhoA ، تم تخبط الجين المشفر في كلا الأليلات وحذفه تحت تأثير المروج البطاني اللمفاوي المستحث لعقار تاموكسيفين Prox1-CreERT2 18. يمكن استزراع LECs المعزولة لمدة تصل إلى أربعة أجيال ، وبعد ذلك تصبح شيخوخة. لقد تم تجميدها وإذا...

Discussion

الجهاز اللمفاوي هو منظم مهم لوظيفة الاستتباب في الجسم ، مع أهم الوظائف هي الحفاظ على بلازما السوائل ، وإزالة المنتجات الثانوية الأيضية الخلوية والجزيئات السامة ، وامتصاص الدهون ، والاتجار بالخلايا المناعية1،19. أثار تحديد العلامات المناسبة انفجارا في البي...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة اليونانية للبحث والابتكار (00376) ، والمعاهد الوطنية للصحة ، والمعهد الوطني للسرطان (NCI) [منحة R15CA231339] ، ومركز العلوم الصحية بجامعة تكساس للتكنولوجيا (TTUHSC) كلية الصيدلة مكتب منحة العلوم (إلى CMM) ، ومن قبل كلية الصيدلة ، تمويل بدء جامعة لويزيانا مونرو ، المعاهد الوطنية للصحة (NIH) من خلال المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة [Grant P20 GM103424-21] والبرنامج الفرعي للتنافسية البحثية (RCS) التابع لمجلس حكام لويزيانا من خلال صندوق دعم مجلس الحكام (LEQSF (2021-24) -RD-A-23) (إلى GM.). تم الحصول على معدات TTUHSC الشائعة المستخدمة من خلال منح معهد أبحاث الوقاية من السرطان في تكساس (CPRIT) RP190524 و RP200572. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو قرار الكتابة أو إعداد المخطوطة. تم إنشاء الملخص الرسومي في الشكل 1A باستخدام BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm Syringe FiltersFisher Scientific09-719C
100 mm Tissue Culture DishesFisher ScientificFB012924
60 mm Tissue Culture DishesFisher ScientificFB012921
Animal Hair ClipperWahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100xFisher Scientific15240-062
Blunt ForcepsFine Science Tools11992-20
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA4919
Cell Strainer 40 μmFisher Scientific542040
Cell Strainer 70 μmFisher Scientific542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat TailCorning354249dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O
Collagenase Type IILife Technologies17101-015
DispaseLife Technologies17105-041
DMEMFisher Scientific11-995-073
DNAse I Solution (2,500 U/mL)Thermo Scientific90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle ConcentratorInvitrogen120-21D
EDTASigma-Aldrich3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium)R&D SystemsCCM027
Euthanasia chamberEuthanex Corporation
Fine ForcepsFine Science Tools11255-20
Fine Scissors-SharpFine Science Tools14060-10
FITC anti-mouse F4/80 AntibodyBiolegend123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic BeadsNew England BiolabsS1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction ChamberEuthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG BeadsThermo Scientific21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBSFisher ScientificAAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1ReliaTech GmbH103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene TubesCorning352063
Syringe Filters w 0.2 μm PoresFisher Scientific09-719C
Trypsin-EDTAFisher Scientific25-300-120

References

  1. Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. The lymphatic vasculature in the 21(st) century: novel functional roles in homeostasis and disease. Cell. 182 (2), 270-296 (2020).
  2. Liu, X., et al. Lymphoangiocrine signals promote cardiac growth and repair. Nature. 588 (7839), 705-711 (2020).
  3. Biswas, L., et al. Lymphatic vessels in bone support regeneration after injury. Cell. 186 (2), 382-397 (2023).
  4. Tammela, T., Alitalo, K. Lymphangiogenesis: molecular mechanisms and future promise. Cell. 140 (4), 460-476 (2010).
  5. Ji, R. C. The role of lymphangiogenesis in cardiovascular diseases and heart transplantation. Heart Failure Reviews. 27 (5), 1837-1856 (2022).
  6. Patnam, M., et al. Lymphangiogenesis guidance mechanisms and therapeutic implications in pathological states of the cornea. Cells. 12 (2), 319 (2023).
  7. Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52691 (2015).
  8. Jackson, D. G. Biology of the lymphatic marker LYVE-1 and applications in research into lymphatic trafficking and lymphangiogenesis. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 112 (7-8), 526-538 (2004).
  9. Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes and Development. 19 (3), 397-410 (2005).
  10. Wolters, G. H., Vos-Scheperkeuter, G. H., Lin, H. C., van Schilfgaarde, R. Different roles of class I and class II Clostridium histolyticum collagenase in rat pancreatic islet isolation. Diabetes. 44 (2), 227-233 (1995).
  11. Kubo, A., Aoki, S., Fujita, H. Whole-mount preparation and microscopic analysis of epidermis. Current Protocols. 2 (7), e464 (2022).
  12. Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
  13. Kazenwadel, J., Michael, M. Z., Harvey, N. L. Prox1 expression is negatively regulated by miR-181 in endothelial cells. Blood. 116 (13), 2395-2401 (2010).
  14. Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
  15. Choi, E. Y., et al. Del-1, an endogenous leukocyte-endothelial adhesion inhibitor, limits inflammatory cell recruitment. Science. 322 (5904), 1101-1104 (2008).
  16. Mikelis, C. M., et al. RhoA and ROCK mediate histamine-induced vascular leakage and anaphylactic shock. Nature Communications. 6, 6725 (2015).
  17. Schledzewski, K., et al. Lymphatic endothelium-specific hyaluronan receptor LYVE-1 is expressed by stabilin-1+, F4/80+, CD11b+ macrophages in malignant tumours and wound healing tissue in vivo and in bone marrow cultures in vitro: implications for the assessment of lymphangiogenesis. Journal of Pathology. 209 (1), 67-77 (2006).
  18. Akwii, R. G., et al. Angiopoietin-2-induced lymphatic endothelial cell migration drives lymphangiogenesis via the beta1 integrin-RhoA-formin axis. Angiogenesis. 25 (3), 373-396 (2022).
  19. Petrova, T. V., Koh, G. Y. Biological functions of lymphatic vessels. Science. 369 (6500), eaax4063 (2020).
  20. Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 453-458 (2003).
  21. Mellor, R. H., et al. Lymphatic dysfunction, not aplasia, underlies Milroy disease. Microcirculation. 17 (4), 281-296 (2010).
  22. Connell, F., Brice, G., Mortimer, P. Phenotypic characterization of primary lymphedema. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 140-146 (2008).
  23. Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. Journal of Pediatris. 164 (2), 383-388 (2014).
  24. Ji, Y., Chen, S., Peng, S., Xia, C., Li, L. Kaposiform lymphangiomatosis and kaposiform hemangioendothelioma: similarities and differences. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 165 (2019).
  25. Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. Journal of Experimental Medicine. 194 (6), 797-808 (2001).
  26. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  27. Garrafa, E., et al. Isolation, purification, and heterogeneity of human lymphatic endothelial cells from different tissues. Lymphology. 38 (4), 159-166 (2005).
  28. Kazenwadel, J., Secker, G. A., Betterman, K. L., Harvey, N. L. In vitro assays using primary embryonic mouse lymphatic endothelial cells uncover key roles for FGFR1 signalling in lymphangiogenesis. PLoS One. 7 (7), e40497 (2012).
  29. Steele, M. M., et al. T cell egress via lymphatic vessels is tuned by antigen encounter and limits tumor control. Nature Immunology. 24 (4), 664-675 (2023).
  30. Mammoto, T., et al. Effects of age-dependent changes in cell size on endothelial cell proliferation and senescence through YAP1. Aging. 11 (17), 7051-7069 (2019).
  31. Regina, C., et al. Vascular ageing and endothelial cell senescence: Molecular mechanisms of physiology and diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 159, 14-21 (2016).
  32. Muhleder, S., Fernandez-Chacon, M., Garcia-Gonzalez, I., Benedito, R. Endothelial sprouting, proliferation, or senescence: tipping the balance from physiology to pathology. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (4), 1329-1354 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

LYVE 1 Cre lox

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved