Isolement des cellules endothéliales lymphatiques dermiques murines

Résumé

Cet article décrit une méthode d’isolement par billes magnétiques de cellules endothéliales murines à partir de capillaires lymphatiques dermiques. Les cellules endothéliales lymphatiques isolées peuvent être utilisées pour des expériences in vitro en aval et l’analyse de l’expression des protéines.

Résumé

Le système lymphatique participe à la régulation de la surveillance immunitaire, de l’absorption des lipides et de l’équilibre des fluides tissulaires. L’isolement des cellules endothéliales lymphatiques murines est un processus important pour la recherche lymphatique, car il permet de réaliser des expériences in vitro et biochimiques sur les cellules isolées. De plus, le développement de la technologie Cre-lox a permis de dénombrer des gènes spécifiques aux tissus qui ne peuvent pas être ciblés à l’échelle mondiale, ce qui a permis de déterminer avec précision leur rôle dans les tissus étudiés. La dissection du rôle de certains gènes dans la physiologie lymphatique et la physiopathologie nécessite l’utilisation de promoteurs spécifiques lymphatiques, et donc, la vérification expérimentale des niveaux d’expression des gènes ciblés.

Les méthodes d’isolement efficace des cellules endothéliales lymphatiques de souris de type sauvage ou transgéniques permettent d’utiliser des essais ex vivo et in vitro pour étudier les mécanismes régulant les fonctions lymphatiques et l’identification des niveaux d’expression des protéines étudiées. Nous avons développé, normalisé et présenté un protocole pour l’isolement efficace des cellules endothéliales lymphatiques dermiques (DLEC) murines par purification par billes magnétiques basée sur l’expression de LYVE-1. Le protocole décrit vise à doter les chercheurs d’un outil permettant de mieux comprendre et d’élucider les acteurs importants des fonctions des cellules endothéliales lymphatiques, en particulier dans les installations où l’équipement de tri cellulaire activé par fluorescence n’est pas disponible.

Introduction

Le système lymphatique joue un rôle central dans la physiologie humaine. Il est considéré comme un facteur homéostatique vital, qui facilite des fonctions importantes, telles que le maintien de l’équilibre hydrique tissulaire-plasmatique, la surveillance immunitaire et l’absorption des lipides¹, ainsi que des fonctions récemment identifiées, telles que la capacité de réparation du cœur² et la capacité de régénération de l’os et l’hématopoïèse³. Malgré le rôle important du système lymphatique, plusieurs aspects du rôle des lymphatiques, ainsi que les mécanismes moléculaires régissant certains param....

Protocole

Les études sur les animaux ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centre des sciences de la santé de l’Université Texas Tech (TTUHSC) pour les expériences au TTUHSC et par l’Administration vétérinaire de la préfecture de Grèce occidentale conformément à la directive 2010/63 pour les expériences à l’Université de Patras. Respectez scrupuleusement les règlements sur l’élimination des déchets lors de l’élimination des déchets animaux.

1. Isolement du derme de souris

1. Jour 1
   REMARQUE : Le jour 1 ; Préparez le matériel et l’....

Discussion

Le système lymphatique est un régulateur important de la fonction homéostatique du corps, les fonctions les plus importantes étant le maintien du plasma liquide, l’élimination des sous-produits du métabolisme cellulaire et des molécules toxiques, l’absorption des lipides et le trafic des cellules immunitaires ^1,19. L’identification de marqueurs appropriés a provoqué une explosion de nouvelles données dans le domaine lymphatique, révélant de nouv.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Syringe Filters	Fisher Scientific	09-719C
100 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012924
60 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012921
Animal Hair Clipper	Wahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100x	Fisher Scientific	15240-062
Blunt Forceps	Fine Science Tools	11992-20
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4919
Cell Strainer 40 μm	Fisher Scientific	542040
Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat Tail	Corning	354249	dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O
Collagenase Type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM	Fisher Scientific	11-995-073
DNAse I Solution (2,500 U/mL)	Thermo Scientific	90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator	Invitrogen	120-21D
EDTA	Sigma-Aldrich	3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium)	R&D Systems	CCM027
Euthanasia chamber	Euthanex Corporation
Fine Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Fine Scissors-Sharp	Fine Science Tools	14060-10
FITC anti-mouse F4/80 Antibody	Biolegend	123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads	New England Biolabs	S1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber	Euthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads	Thermo Scientific	21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS	Fisher Scientific	AAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	SH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1	ReliaTech GmbH	103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene Tubes	Corning	352063
Syringe Filters w 0.2 μm Pores	Fisher Scientific	09-719C
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25-300-120