マウス真皮リンパ管内皮細胞の単離

要約

この論文では、真皮リンパ管からマウス内皮細胞を磁気ビーズベースで単離する方法について説明しています。単離されたリンパ内皮細胞は、下流の in vitro 実験やタンパク質発現解析に使用できます。

要約

リンパ系は、免疫監視、脂質吸収、および組織液バランスの調節に関与しています。マウスリンパ内皮細胞の単離は、単離された細胞に対する in vitro および生化学実験の実施を可能にするため、リンパ研究にとって重要なプロセスです。さらに、Cre-lox技術の開発により、全球的に標的とすることはできませんが、組織特異的な遺伝子の欠損が可能になり、研究組織におけるそれらの役割の正確な決定につながりました。リンパ生理学および病態生理学における特定の遺伝子の役割を解剖するには、リンパ管特異的プロモーターの使用が必要であり、したがって、標的遺伝子の発現レベルの実験的検証が必要です。

野生型マウスまたはトランスジェニックマウスからリンパ管内皮細胞を効率的に単離する方法により、 ex vivo および in vitro アッセイを使用して、リンパ機能の調節メカニズムを研究し、研究されたタンパク質の発現レベルの同定が可能になります。私たちは、LYVE-1発現に基づく磁気ビーズ精製によるマウスの真皮リンパ内皮細胞(DLEC)の効率的な単離のためのプロトコルを開発、標準化、および提示しました。概説されているプロトコルは、特に蛍光活性化細胞ソーティング装置が利用できない施設において、リンパ管内皮細胞機能の重要なプレーヤーをさらに理解し、解明するためのツールを研究者に提供することを目的としています。

概要

リンパ系は、人間の生理機能において極めて重要な役割を果たしています。これは、組織と血漿液のバランスの維持、免疫監視、^{脂質吸収などの}重要な機能を促進する重要な恒常性因子1と考えられており、心臓の修復能力² や骨や造血の再生能力³など、最近同定された機能を促進します。リンパ系の重要な役割にもかかわらず、リンパ管の役割のいくつかの側面、および特定の生理学的パラメータと応答を支配する分子メカニズムは、とらえどころのないままです。さらに、リンパ管の血管障害は、特定の病態生理学的状態の引き金となるか、または悪化させる要因です。よく知られている例は、疾患の遺伝的起源または非遺伝的起源に応じて、それぞれ原発性リンパ腫と続発性リンパ腫ですが、原発性腫瘍の成長と転移性播種に対するリンパ系の役割は、転移の導管および免疫機能の調節因子として機能する可能性があるため、極めて重要です¹。

血液血管系と比較してリンパ管の研究と知識の遅れは、主に血液血管系と比較してリンパ系の発見が遅れたことと、リンパ管特異的分子マーカーの同定が遅れることによるものです。これはここ数十年で大幅に改善され、定常状態および疾患状態のリンパ管の従来の図式の変更につながりました¹。血管新生と同様に、リンパ管新生は既存のリンパ管から新しいリンパ管を形成することであり、広範囲の疾患の発症において極めて重要な役割を果たします^4,5,6。しかし、血管新生とは異なり、リンパ管新生の研究は、病理モデルの発生血管形成と構造的欠陥に焦点を当てたin vivoモデルに限られてきました。リンパ管内皮細胞の単離は、in vitro研究にとって重要であり、これは提示されたプロトコルによって提供することができる。

マウスからのリンパ内皮単離のためのいくつかのプロトコルが開発されており、蛍光活性化細胞ソーティング⁷の使用が必要である。セルソーターの利点は、利用可能な場合、ビーズベースの単離とは対照的に、純度が高く、後者の方がより高い収率を提供することです。このプロトコールは、リンパ管内の細胞輸送に重要なリンパ内皮マーカーであるリンパ管内皮HA受容体1(LYVE-1)の発現を利用している^4,8。LYVE-1の発現はリンパ管に限定され、集リンパ管には限られていないため、この技術は、すべてのリンパ管内^皮細胞に均一に発現するポドプラニンなどの他のリンパマーカーとは対照的に、リンパ管からリンパ管内皮細胞を特異的に単離するのに適している9。プロトコールでは、Prox1 など、膜貫通型ではない他の重要なリンパマーカーを除外しました。

生理学的転帰はリンパ管新生であり、通常はリンパ管で開始されるため、LYVE-1はこれらの細胞での選択性があり、選択した抗体が高収量を提供したため、標的として選択されました。使用した酵素は、I型よりもコラーゲン解離に効果的であることが一般に知られているII型コラゲナーゼ¹⁰と、真皮-表皮分離に定期的に使用される広汎なプロテアーゼであるディスパーゼ¹¹でした。しかし、組織分離のための他の酵素が報告されており^12,13、使用することができる。このプロトコルの目標は、特に蛍光活性化細胞の選別が容易に利用できない場所で、磁気ビーズ精製を使用して、成体マウスのリンパ管から高収率で真皮リンパ管内皮細胞を単離する方法を説明することです。この方法は、リンパ管内皮細胞の純度がダウンストリームアプリケーションのために損なわれる可能性のあるアプリケーションに適しています。

プロトコル

動物実験は、TTUHSCでの実験についてはテキサス工科大学健康科学センター(TTUHSC)の動物管理・使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルに従って、パトラス大学での実験については西ギリシャ県の獣医局によって承認されたプロトコルに従って実施されました。動物の廃棄物を処分するときは、廃棄物処理規則を熱心に従ってください。

1. マウス真皮の単離

1. 1日目
   注:1日目。麻酔チャンバー、動物のバリカン、イソフルラン、細かい鉗子、0.2μmシリンジフィルター。
   1. DMEM中の2 mg/mLディスパーゼ溶液を1x Antibiotic-Antimycotic Solutionと共に調製し、ろ過滅菌します。
      注:ミディアムまたはPBSの使用は、他の報告されたプロトコル¹²で成功裏に使用されているため、HBSSに置き換えることができる。1x Antibiotic-Antimycotic Solutionは、ペニシリン(100 I.U./mL)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)、およびアンホテリシン(2.5 μg/mL)を添加することで置換できます。
   2. イソフルラン投与(0.5-2%イソフルラン、流量:1 L / min)でマウスを麻酔室に置いてマウスを麻酔します。マウスの動きが止まったら、ケージからマウスを移し、同様のイソフルランの流れでノーズコーンを調整して麻酔を続けます。動物をつま先でつまんで十分な麻酔レベルを確認し、マウスを常に監視して深い麻酔が維持されている(運動性がない)ことを確認します。背側と腹側の毛皮(マウスの背中と腹部)の約9 cm² を、バリカンを使用して正中線に沿って縦方向にクリップします。マウスを麻酔から回復させ、ケージに戻します。
      注:脱毛(脱毛)クリームを代わりに使用できます。皮膚の完全性を維持しながら、分離する皮膚領域で毛皮が完全に除去されていることを確認してください。できるだけ長い皮膚領域をクリップしてみてください。脱毛による潜在的な炎症を確実に解決するためには、翌日に細胞の分離を行う必要があります。単離された細胞の数を増やすには、グループごとに2〜4匹のマウスをプールします。
2. 2日目
   注:次の材料と機器を準備してください:安楽死チャンバー、バイオセーフティキャビネット、CO₂ インキュベーター、エタノール、細かいはさみ、細かい鉗子、鈍い鉗子、100 mm組織培養プレート、ディスパーゼ、DMEM、1x抗生物質-抗真菌薬溶液。
   1. CO₂ 投与によりマウスを安楽死させ、仰臥位にして、切り取られた領域を露出させます。消毒剤として70%エタノールをスプレーします。
      注:このステップ以降、すべてのステップは無菌条件下で(バイオセーフティキャビネット内)実行する必要があります。
   2. 滅菌済みの100 mm組織培養プレートを氷上に置きます。
   3. 腹部に0.5インチの表面的な切り込みを入れ、首と下腹部の正中線に沿って縦方向に切ります。皮膚をフラップして開くことができるように、横方向に切り込みを入れます。
      注意: 切開サイズと分離された皮膚領域は、マウスのサイズによって異なります。
   4. 鈍い鉗子を使用して、皮膚を周囲の組織から慎重に分離します。マウスの胴体全体を一周し、首と下腹部の周りの皮膚を横方向に切ります。
   5. 100 mmの組織培養プレートに、真皮側を下に向けて慎重に皮膚をセットし、皮膚をできるだけ伸ばした状態に保ちます。プレートを覆い、氷の上に保ちます。グループからすべてのマウスの分離を完了します。
   6. すべてのマウスから皮膚を抽出した後、プレートを室温で10分間インキュベートし、外植片を平らにします。
   7. 6 mLのディスパーゼ溶液をプレートに加え、皮膚が完全に浸漬されていることを確認し、4°Cで軽度の撹拌を行いながら一晩インキュベートします。
      注:ディスパーゼの代わりに、トリプシン消化も行うことができます¹²、続いてコラゲナーゼII型治療の代わりにリベラーゼを行うことができます(下)。

2.真皮からの細胞分離

1. 3日目
   注:次の材料と機器を準備してください:遠心分離機、CO₂ インキュベーター、バイオセーフティキャビネット、はさみ、DMEM、1x抗生物質-抗真菌剤溶液、コラゲナーゼII型、PBS、50 mLコニカルチューブ、100 mmおよび60 mm組織培養プレート、DNAse I溶液、コラーゲンI型、70 μmおよび40 μm細胞ストレーナー、0.2 μmシリンジフィルター、LEC培地。
   1. 1x PBS(1.37 M NaCl、27 mM KCl、100 mM Na₂HPO₄、18 mM KH₂PO₄、pH 7.4)500 mLを調製し、15 psiで20分間オートクレーブするか、フィルター滅菌します。あるいは、市販の滅菌PBSを使用してください。
   2. 10 mLの2 mg/mLコラゲナーゼII型溶液をDMEMで調製し、1倍抗生物質-抗真菌剤溶液でろ過滅菌します。
      注:滅菌フードの下で次の手順を実行して、サンプル汚染の可能性を減らします。
   3. ピペットを使用して、皿から液体を取り除きます。
   4. 鉗子を使用して真皮(皮膚の下)を表皮(上)から分離し、明らかな脂肪組織をすべて取り除きます。真皮を清潔な組織培養プレートに移します。
   5. 清潔な組織培養プレートに1 mLのDMEMと1x Antibiotic-Antimycotic Solutionを加え、液体がプレートの片側に蓄積するように傾けます。
   6. 真皮を1〜2 mm² 個に細かく刻み、新しい50 mLの円錐管に移します。
      注:このステップは、より長い処理がより高い収量または細胞生存を提供することが期待されないため、理想的には4〜5分以内に完了する必要があります。
   7. コラゲナーゼII型溶液10 mLを加えます。
   8. 50 μL(25ユニット/mLの溶液)をDNAse I溶液(細胞凝集を減少させる)を加え、真皮溶液を37°Cで2時間連続的に攪拌しながら消化します(30-50 rpmで回転/振とうするインキュベーターを使用)。
      注:真皮の大部分が消化されているかどうかを定期的に確認してください。そうでない場合は、可能であれば、消化時間(最大1時間余分に)と攪拌速度を上げます。
   9. 60 mm組織培養プレートに2 mLの10 μg/mLコラーゲンI型を0.02 M酢酸溶液でコーティングし、37°Cで>20分間。 滅菌PBSで2回洗浄します。
   10. 70 μmの細胞ストレーナーを使用して細胞懸濁液をろ過し、250 × g で5分間遠心分離します。上清を捨てます。
   11. 10 mLのDMEMに1x Antibiotic-Antimycotic Solutionと共に再懸濁します。
   12. 40 μmの細胞ストレーナーを使用して細胞懸濁液をろ過し、250 × g で5分間遠心分離します。上清を捨てます。
   13. 1 mLの完全LEC培地(Endothelial Cell Growth Base Medium with Supplement)に再懸濁します。
   14. コラーゲンコーティングされた60 mm組織培養プレートで細胞を完全なLEC培地にプレート化します。これは細胞培養の0日目になります。
   15. 2日ごとに細胞を1x PBSで2回洗浄し、新しいLEC培地を追加して、培地を交換します。
   16. セルが80〜90%コンフルエントになるまで、手順2.1.15を繰り返します。
       注:細胞が80〜90%コンフルエントになる前に精製を行うと、分離されるリンパ内皮細胞が少なくなります。このプロセスには約7〜10日かかります。

3. LYVE-1抗体による磁気ビーズコーティング

注:精製ステップの1日前に、次の材料と機器を準備してください:4°C冷蔵庫、ローター、磁気セパレーター、PBS、抗ウサギIgG磁気ビーズ、微量遠心チューブ、0.2μmシリンジフィルター、磁気ビーズコーティング溶液、LYVE-1抗体。

1. マグネティックビーズコーティング溶液を調製します:0.1%BSAおよび2mM EDTAを含むPBS20mLを調製し、フィルター滅菌します。4°Cで保存してください。
   注:数日以上の保管はお勧めしません。使用前に沈殿物や汚染がないか確認してください。
2. 500 μL の抗ウサギ IgG 磁気ビーズを微量遠心チューブにピペットで移し、1 mL の氷冷磁気ビーズコーティング溶液を加えます。
3. 磁気セパレーターを使用してビーズを洗浄します。
4. 氷冷したマグネティックビーズコーティング溶液1mLで洗浄を2回繰り返します。
5. ビーズを500 μLの磁気ビーズコーティング溶液に再懸濁し、微量遠心チューブに150 μLのアリコートを作製します。
6. 各チューブに15 μgのLYVE-1抗体を添加します(1 mg/mL抗体ストック濃度から15 μL)。
7. 4°Cで一晩インキュベートし、連続的に撹拌します。

4. リンパ管内皮細胞の精製

注:次の材料と機器を準備してください:CO₂ インキュベーター、シェーカー、タイマー、パラフィルム、DMEM、1x抗生物質-抗真菌溶液、BSA、PBS、磁気ビーズコーティング溶液、トリプシン-EDTA、100 mmまたは60 mm組織培養プレート、0.2 μmシリンジフィルター、コラーゲンI型、酢酸、LEC培地。

1. 1x Antibiotic-Antimycotic Solutionおよび0.1% BSAを含む50 mLのDMEMを調製し、濾過滅菌します。
2. 60 mm組織培養プレートに10 μg/mLコラーゲンI型を0.02 M酢酸溶液でコーティングし、37°Cで>20分間加熱します。 滅菌PBSで2回洗浄します。
3. プレコートされたビーズを、マグネティックセパレーターを使用して1mLのマグネティックビーズコーティング溶液で洗浄します。
4. ビーズを150 μLのDMEMに0.1% BSAで再懸濁します。
   注:ビーズは4°Cで最大1ヶ月間保存できるようになりました。
5. 細胞をPBSで2回洗浄します。
6. 0.1% BSAを含むDMEM3 mL(60 mm組織培養プレート用)と抗体標識ビーズ50 μLを細胞に加えます。
   注:2匹以上のマウスの細胞をプールする場合は、100 mm組織培養プレートを使用し、0.1% BSAを含む6 mLのDMEMを添加します。
7. 皿をパラフィルムで密封します。
8. RTで10 RPMで撹拌するシェーカーに皿を置き、正確に10分間インキュベートします。
   注:インキュベーションが長くなると、非特異的結合が生じます。ビーズがプレート表面全体と相互作用するように、プレートが揺れ続ける間、数分ごとにプレートを手動で回転させます。
9. 培地を捨て、細胞をPBSで一度洗浄します。細胞を迅速に検査して、プレート上のLECコロニーの存在を確認します。
10. 細胞をトリプシン化する:1 mLのトリプシン-EDTAを使用し、37°Cで3分間インキュベートします。 細胞の剥離が成功したかどうか細胞を検査します。
11. 2 mLの完全LEC培地で溶液を中和し、溶液を5 mLの滅菌ポリプロピレンチューブに移します。
12. 磁気セパレーターを使用して、4 x 3 mLのDMEMを0.1% BSAで細胞を洗浄し、結合していない細胞を除去します。
13. 残りのビーズ結合細胞を完全なLEC培地に再懸濁し、以前にコラーゲンでコーティングした60 mm組織培養プレートにプレートします。
14. 細胞を37°Cでインキュベートし、PBSを毎回2回洗浄した後、隔日で培地を交換します。
15. 細胞がコンフルエントに達するまで培養します(通常7〜10日かかります)。
16. その時点で、顕微鏡下で細胞の密度を確認し、フローサイトメトリー用の細胞の準備を進めます。高いF4/80+パーセンテージが特定された場合は、LYVE-1で精製ステップを繰り返します(ステップ4:リンパ内皮細胞精製)再度、または理想的には別のリンパマーカー(すなわち、ポドプラニン¹⁴)を使用します。
    注:磁気ビーズ精製細胞集団上の抗体によって標的とされるタンパク質の高発現が実証されている^15,16。しかし、LYVE-1については、他のLYVE-1+細胞(主にマクロファージ)の割合を同定するために、フローサイトメトリーコントロールを行うことが重要です。LYVE-1は、腫瘍や創傷に関連するマクロファージのサブセットでのみ発現するが、健康な皮膚では、LYVE-1の発現はリンパ管内皮細胞により制限される¹⁷。したがって、F4/80スクリーニングは必須ではなく、実験の状況に依存します。デモンストレーションに使用したマウスには腫瘍や創傷はなく、脱毛による潜在的な炎症のみがありましたが、LYVE-1+マクロファージの割合のベースラインとしてF4/80染色を含めました。

5. フローサイトメトリー

注:次の材料と機器を準備してください:遠心分離機、CO₂ インキュベーター、タイマー、血球計算盤、EDTA溶液、1x抗生物質-抗真菌薬溶液、BSA、PBS、トリプシン-EDTA、ポリプロピレンチューブ、0.2μmシリンジフィルター、70%エタノール、F4 / 80 FITC標識抗体。

1. 0.1% BSAを含むPBSを調製し、フィルター滅菌します。
2. PBSで1 mM EDTA溶液を調製します。
3. 細胞をトリプシン処理する:細胞を1 mLの1 mM EDTA溶液と37°Cで5分間インキュベートします。
   注:EDTA溶液によるインキュベーションは、細胞剥離のより穏やかな方法であり、膜貫通タンパク質をよりよく保存し、好ましいが、より長いインキュベーション期間を必要とする。あるいは、トリプシン-EDTA溶液を37°Cで1分間インキュベーションすることもできますが、これはフローサイトメトリーアプリケーションの抗体親和性に影響を与える可能性があります。
4. 2 mLの完全LEC培地で溶液を中和し、溶液を5 mLの滅菌ポリプロピレンチューブに移します。
5. サンプルを250 × g で5分間遠心分離します。
6. PBSで洗ってください。
7. 遠心分離とPBS洗浄を繰り返します。
8. 0.1% BSAを含むPBSに細胞を再懸濁し、血球計算盤または代替法を使用してカウントします。~1 × 10⁶ セルをポリプロピレンチューブに分注し、最終容量は100 μlです。このステップ以降、すべてのステップを4°Cで実行します。
   注:細胞は染色前に固定することも、生きている間に染色することもできます。固定は、一部の抗体が固定後に抗原を検出しない場合があるため、フローサイトメトリーには最適ではない可能性があります。したがって、フローサイトメトリーは前のステップの直後に実行し、固定ステップはスキップすることをお勧めします。それが不可能な場合は、フローサイトメトリー実験の前に固定することで、フローサイトメトリーのステップを遅らせることができます。固定を行う場合は、固定細胞の状況での抗体の性能を事前に評価する必要があります。
9. 固定を行います(オプションのステップ;細胞を固定しない場合は、免疫染色に進みます):細胞を氷冷した70%エタノールに再懸濁し、氷上で10分間穏やかに混合します。
   注:エタノール固定は細胞を透過化し、GFPの放出につながる可能性があります。しかし、パラホルムアルデヒドベースの固定は、フローサイトメトリーに使用される色素を破壊する可能性があり、理想的には回避することができます。
10. 室温で15分間インキュベートします。
11. 細胞を250 × g で遠心分離し、1x PBSで5分間2回洗浄します。
12. 次のステップに進むか、細胞を0.5-1 mLの1x PBSに再懸濁し、4°Cで保存します。

6. 免疫染色

注:細胞を優しく取り扱い、可能であれば長時間のピペッティングを避けて、細胞膜の完全性を維持し、細胞死を最小限に抑え、細胞が凝集を形成しないようにします。単離された内皮細胞から、次のグループを準備します:未染色細胞と別の内皮細胞マーカー(すなわち、VEGFR3、ポドプラニン)、F4/80、および両方で染色された細胞。市販のマウスリンパ内皮細胞およびマクロファージ(利用可能な場合)をポジティブコントロールとして含める。デモンストレーションの目的で、内因性のtdTomato蛍光(PE+)のため、FITC標識F4/80染色を使用しました。

1. PBS中の一次抗体を0.1% BSAで希釈し、推奨希釈または最適化された希釈率に従ってください。細胞懸濁液100 μLに、F4/80 FITC標識抗体0.5 μg (抗体溶液1 μL) を添加します。
2. 希釈した蛍光標識抗体を添加した後、細胞を再懸濁します。ポリプロピレンチューブをフリックして混合し、塊がなく、すべての細胞が適切にコーティングされていることを確認します。
3. 室温(固定細胞)で1時間、または暗所で氷上(生細胞)で30分間インキュベートします。
4. 暗所で0.1% BSA含有PBSを使用して、細胞を250 × g で5分間遠心分離し、4°C(生細胞の場合)または室温(固定細胞の場合)で2回洗浄します。
5. 非蛍光標識抗体の場合
   1. 蛍光色素標識二次抗体をインキュベーションバッファーで希釈します。Alexa Flour抗体には、1:500の希釈を使用してください。
   2. 二次抗体を細胞懸濁液100 μLに加えます。
   3. 室温(固定細胞)または氷上(生細胞)で30分間インキュベートします。
   4. インキュベーションバッファー内で、250 × g 、4°C(生細胞の場合)または室温(固定細胞の場合)で5分間遠心分離し、2回洗浄します。
6. 0.5 mLの1x PBSに細胞を再懸濁し、フローサイトメーターを使用して解析します。
7. 以下のゲーティング戦略の手順に従って、LYVE-1発現細胞内のマクロファージ集団を同定します。
   1. 細胞集団を区別するために、前方散乱と側方散乱を考慮します。
   2. セルのサイズ、面積、高さの前方散乱を考慮して、単一のセル (一重項) を区別します。
   3. tdTomato(PE)を発現する単離マウス細胞内のマクロファージ(F4/80+)を同定するには、F4/80(FITC)の発現とRFP(PE)の発現を考慮に入れてください(後述の特定のマウスに蛍光tdTomatoレポーターが存在するため)。

結果

この方法は、タモキシフェン誘導性リンパ管内皮特異的プロ モーターProx1-CreER^{T2 18}の影響下で、そのコード遺伝子が両方の対立遺伝子でfloxedされ、欠失した小さなGTPase、RhoAのタンパク質発現を同定するために開発されました。単離されたLECは、最大4世代にわたって培養することができ、その後、老化します。それらは凍結され、解凍され、アンジオポエチン-...

ディスカッション

リンパ系は、体の恒常性維持機能の重要な調節因子であり、最も重要な機能は、流体血漿の維持、細胞代謝副産物および毒性分子の除去、脂質吸収、および免疫細胞の輸送である^1,19。適切なマーカーの同定は、リンパ学分野での新たなデータの爆発的な増加を引き起こし、リンパ管の新たな機能、例えば、特定の臓器の修復および再生能力におけ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Syringe Filters	Fisher Scientific	09-719C
100 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012924
60 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012921
Animal Hair Clipper	Wahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100x	Fisher Scientific	15240-062
Blunt Forceps	Fine Science Tools	11992-20
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4919
Cell Strainer 40 μm	Fisher Scientific	542040
Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat Tail	Corning	354249	dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O
Collagenase Type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM	Fisher Scientific	11-995-073
DNAse I Solution (2,500 U/mL)	Thermo Scientific	90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator	Invitrogen	120-21D
EDTA	Sigma-Aldrich	3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium)	R&D Systems	CCM027
Euthanasia chamber	Euthanex Corporation
Fine Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Fine Scissors-Sharp	Fine Science Tools	14060-10
FITC anti-mouse F4/80 Antibody	Biolegend	123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads	New England Biolabs	S1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber	Euthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads	Thermo Scientific	21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS	Fisher Scientific	AAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	SH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1	ReliaTech GmbH	103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene Tubes	Corning	352063
Syringe Filters w 0.2 μm Pores	Fisher Scientific	09-719C
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25-300-120