マウス真皮リンパ管内皮細胞の単離

要約

この論文では、真皮リンパ管からマウス内皮細胞を磁気ビーズベースで単離する方法について説明しています。単離されたリンパ内皮細胞は、下流の in vitro 実験やタンパク質発現解析に使用できます。

要約

リンパ系は、免疫監視、脂質吸収、および組織液バランスの調節に関与しています。マウスリンパ内皮細胞の単離は、単離された細胞に対する in vitro および生化学実験の実施を可能にするため、リンパ研究にとって重要なプロセスです。さらに、Cre-lox技術の開発により、全球的に標的とすることはできませんが、組織特異的な遺伝子の欠損が可能になり、研究組織におけるそれらの役割の正確な決定につながりました。リンパ生理学および病態生理学における特定の遺伝子の役割を解剖するには、リンパ管特異的プロモーターの使用が必要であり、したがって、標的遺伝子の発現レベルの実験的検証が必要です。

野生型マウスまたはトランスジェニックマウスからリンパ管内皮細胞を効率的に単離する方法により、 ex vivo および in vitro アッセイを使用して、リンパ機能の調節メカニズムを研究し、研究されたタンパク質の発現レベルの同定が可能になります。私たちは、LYVE-1発現に基づく磁気ビーズ精製によるマウスの真皮リンパ内皮細胞(DLEC)の効率的な単離のためのプロトコルを開発、標準化、および提示しました。概説されているプロトコルは、特に蛍光活性化細胞ソーティング装置が利用できない施設において、リンパ管内皮細胞機能の重要なプレーヤーをさらに理解し、解明するためのツールを研究者に提供することを目的としています。

概要

リンパ系は、人間の生理機能において極めて重要な役割を果たしています。これは、組織と血漿液のバランスの維持、免疫監視、^{脂質吸収などの}重要な機能を促進する重要な恒常性因子1と考えられており、心臓の修復能力² や骨や造血の再生能力³など、最近同定された機能を促進します。リンパ系の重要な役割にもかかわらず、リンパ管の役割のいくつかの側面、および特定の生理学的パラメータと応答を支配する分子メカニズムは、とらえどころのないままです。さらに、リンパ管の血管障害は、特定の病態生理学的状態の引き金となるか、または悪化させる要因です。よく知られている例は、疾患の遺伝的起源または非遺伝的起源に応じて、それぞれ原発性リンパ腫と続発性リンパ腫ですが、原発性腫瘍の成長と転移性播種に対するリンパ系の役割は、転移の導管および免疫機能の調節因子として機能する可能性があるため、極めて重要です¹。

血液血管系と比較してリンパ管の研究と知識の遅れは、主に血液血管系と比較してリンパ系の発見が遅れたことと、リンパ管特異的分子マーカーの同定が遅れることによるものです。これはここ数十年で大幅に改善され、定常状態および疾患状態のリンパ管の従来の図式の変更につながりました¹。血管新生と同様に....

プロトコル

動物実験は、TTUHSCでの実験についてはテキサス工科大学健康科学センター(TTUHSC)の動物管理・使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルに従って、パトラス大学での実験については西ギリシャ県の獣医局によって承認されたプロトコルに従って実施されました。動物の廃棄物を処分するときは、廃棄物処理規則を熱心に従ってください。

1. マウス真皮の単離

1. 1日目
   注:1日目。麻酔チャンバー、動物のバリカン、イソフルラン、細かい鉗子、0.2μmシリンジフィルター。
   1. DMEM中の2 mg/mLディスパーゼ溶液を1x Antibiotic-Antimycotic Solutionと共に調製し、ろ過滅菌します。
      注:ミディアムまたはPBSの使用は、他の報告されたプロトコル¹²で成功裏に使用されているため、HBSSに置き換えることができる。1x Antibiotic-Antimycotic Solutionは、ペニシリン(100 I.U./mL)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)、およびアンホテリシン(2.5 μg/mL)を添加することで置換できます。
   2. イソフルラン投与(0.5-2%イソフルラン、流量:1 L / min)でマウスを麻酔室に置いてマウスを麻酔します。マウスの動きが止まったら、ケージからマウスを移し、同様のイソフル....

ディスカッション

リンパ系は、体の恒常性維持機能の重要な調節因子であり、最も重要な機能は、流体血漿の維持、細胞代謝副産物および毒性分子の除去、脂質吸収、および免疫細胞の輸送である^1,19。適切なマーカーの同定は、リンパ学分野での新たなデータの爆発的な増加を引き起こし、リンパ管の新たな機能、例えば、特定の臓器の修復および再生能力におけ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Syringe Filters	Fisher Scientific	09-719C
100 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012924
60 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012921
Animal Hair Clipper	Wahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100x	Fisher Scientific	15240-062
Blunt Forceps	Fine Science Tools	11992-20
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4919
Cell Strainer 40 μm	Fisher Scientific	542040
Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat Tail	Corning	354249	dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O
Collagenase Type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM	Fisher Scientific	11-995-073
DNAse I Solution (2,500 U/mL)	Thermo Scientific	90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator	Invitrogen	120-21D
EDTA	Sigma-Aldrich	3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium)	R&D Systems	CCM027
Euthanasia chamber	Euthanex Corporation
Fine Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Fine Scissors-Sharp	Fine Science Tools	14060-10
FITC anti-mouse F4/80 Antibody	Biolegend	123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads	New England Biolabs	S1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber	Euthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads	Thermo Scientific	21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS	Fisher Scientific	AAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	SH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1	ReliaTech GmbH	103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene Tubes	Corning	352063
Syringe Filters w 0.2 μm Pores	Fisher Scientific	09-719C
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25-300-120