Aislamiento de células endoteliales linfáticas dérmicas murinas

Resumen

Este artículo describe un método para el aislamiento basado en perlas magnéticas de células endoteliales murinas de capilares linfáticos dérmicos. Las células endoteliales linfáticas aisladas se pueden utilizar para experimentos in vitro posteriores y análisis de expresión de proteínas.

Resumen

El sistema linfático participa en la regulación de la vigilancia inmunitaria, la absorción de lípidos y el equilibrio de líquidos tisulares. El aislamiento de células endoteliales linfáticas murinas es un proceso importante para la investigación linfática, ya que permite la realización de experimentos in vitro y bioquímicos en las células aisladas. Además, el desarrollo de la tecnología Cre-lox ha permitido la deficiencia de genes específicos de tejido que no se pueden abordar globalmente, lo que ha llevado a la determinación precisa de su papel en los tejidos estudiados. La disección del papel de ciertos genes en la fisiología linfática y la fisiopatología requiere el uso de promotores linfáticos específicos y, por lo tanto, la verificación experimental de los niveles de expresión de los genes objetivo.

Los métodos para el aislamiento eficiente de células endoteliales linfáticas de ratones salvajes o transgénicos permiten el uso de ensayos ex vivo e in vitro para estudiar los mecanismos que regulan las funciones linfáticas y la identificación de los niveles de expresión de las proteínas estudiadas. Hemos desarrollado, estandarizado y presentado un protocolo para el aislamiento eficiente de células endoteliales linfáticas dérmicas murinas (DLECs) mediante purificación magnética de perlas basadas en la expresión de LYVE-1. El protocolo descrito tiene como objetivo equipar a los investigadores con una herramienta para comprender mejor y dilucidar los actores importantes de las funciones de las células endoteliales linfáticas, especialmente en instalaciones donde no se dispone de equipos de clasificación de células activadas por fluorescencia.

Introducción

El sistema linfático desempeña un papel fundamental en la fisiología humana. Se considera un factor homeostático vital, que facilita funciones importantes, como el mantenimiento del equilibrio de líquidos tejido-plasmático, la vigilancia inmunitaria y la absorción de lípidos¹, así como funciones recientemente identificadas, como la capacidad de reparación del corazón² y la capacidad regenerativa del hueso y la hematopoyesis³. A pesar del importante papel del sistema linfático, varios aspectos del papel de los linfáticos, así como los mecanismos moleculares que gobiernan ciertos parámetros fisiológ....

Protocolo

Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Tecnológica de Texas (TTUHSC) para los experimentos en TTUHSC y por la Administración Veterinaria de la Prefectura de Grecia Occidental de acuerdo con la Directiva 2010/63 para los experimentos en la Universidad de Patras. Siga diligentemente las normas de eliminación de residuos al deshacerse de los materiales de desecho de animales.

1. Aislamiento de la dermis del ratón

1. Día 1
   NOTA: El día 1; Prepare los siguientes m....

Discusión

El sistema linfático es un importante regulador de la función homeostática del organismo, siendo las funciones más importantes el mantenimiento del plasma líquido, la eliminación de subproductos del metabolismo celular y moléculas tóxicas, la absorción de lípidos y el tráfico de células inmunitarias ^1,19. La identificación de marcadores apropiados ha provocado una explosión de nuevos datos en el campo linfático, revelando nuevas funciones de la vas.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Syringe Filters	Fisher Scientific	09-719C
100 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012924
60 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012921
Animal Hair Clipper	Wahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100x	Fisher Scientific	15240-062
Blunt Forceps	Fine Science Tools	11992-20
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4919
Cell Strainer 40 μm	Fisher Scientific	542040
Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat Tail	Corning	354249	dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O
Collagenase Type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM	Fisher Scientific	11-995-073
DNAse I Solution (2,500 U/mL)	Thermo Scientific	90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator	Invitrogen	120-21D
EDTA	Sigma-Aldrich	3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium)	R&D Systems	CCM027
Euthanasia chamber	Euthanex Corporation
Fine Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Fine Scissors-Sharp	Fine Science Tools	14060-10
FITC anti-mouse F4/80 Antibody	Biolegend	123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads	New England Biolabs	S1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber	Euthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads	Thermo Scientific	21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS	Fisher Scientific	AAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	SH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1	ReliaTech GmbH	103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene Tubes	Corning	352063
Syringe Filters w 0.2 μm Pores	Fisher Scientific	09-719C
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25-300-120