Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücre İzolasyonu
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Bu Makalede
Özet
Bu makale, murin endotel hücrelerinin dermal lenfatik kılcal damarlardan manyetik boncuk bazlı izolasyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. İzole edilmiş lenfatik endotel hücreleri, aşağı akış in vitro deneyler ve protein ekspresyon analizi için kullanılabilir.
Özet
Lenfatik sistem, bağışıklık sürveyansı, lipid emilimi ve doku sıvı dengesinin düzenlenmesine katılır. Murin lenfatik endotel hücrelerinin izolasyonu, izole edilen hücreler üzerinde in vitro ve biyokimyasal deneylerin yapılmasına izin verdiği için lenfatik araştırmalar için önemli bir süreçtir. Ayrıca, Cre-lox teknolojisinin gelişimi, küresel olarak hedeflenemeyen genlerin dokuya özgü eksikliğini mümkün kılmış ve incelenen dokulardaki rollerinin kesin olarak belirlenmesine yol açmıştır. Lenfatik fizyoloji ve patofizyolojide belirli genlerin rolünün diseksiyonu, lenfatik spesifik promotörlerin kullanılmasını ve dolayısıyla hedeflenen genlerin ekspresyon seviyelerinin deneysel olarak doğrulanmasını gerektirir.
Lenfatik endotel hücrelerinin vahşi tip veya transgenik farelerden verimli bir şekilde izole edilmesine yönelik yöntemler, lenfatik fonksiyonları düzenleyen mekanizmaları incelemek ve incelenen proteinlerin ekspresyon seviyelerinin tanımlanması için ex vivo ve in vitro tahlillerin kullanılmasını sağlar. LYVE-1 ekspresyonuna dayalı manyetik boncuk saflaştırması yoluyla murin dermal lenfatik endotel hücrelerinin (DLEC'ler) verimli izolasyonu için bir protokol geliştirdik, standartlaştırdık ve sunduk. Ana hatlarıyla belirtilen protokol, araştırmacıları, özellikle floresanla aktive edilen hücre ayırma ekipmanının bulunmadığı tesislerde, lenfatik endotel hücre fonksiyonlarının önemli oyuncularını daha iyi anlamak ve aydınlatmak için bir araçla donatmayı amaçlamaktadır.
Giriş
Lenfatik sistem insan fizyolojisinde çok önemli bir rol oynar. Doku-plazma sıvı dengesinin korunması, immün sürveyans ve lipid emilimi1 gibi önemli işlevlerin yanı sıra kalbin 2 onarım yeteneği ve kemikve hematopoezin rejeneratif kapasitesi gibi yakın zamanda tanımlanan işlevleri kolaylaştıran hayati bir homeostatik faktör olarak kabul edilir3. Lenfatik sistemin önemli rolüne rağmen, lenfatiklerin rolünün çeşitli yönlerinin yanı sıra belirli fizyolojik parametreleri ve yanıtları yöneten moleküler mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. Ayrıca, lenfatik vasküler defektler bazı patofizyolojik duru....
Protokol
Hayvan çalışmaları, TTUHSC'deki deneyler için Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi (TTUHSC) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından ve Patras Üniversitesi'ndeki deneyler için 2010/63 sayılı Direktife göre Batı Yunanistan Valiliği Veterinerlik İdaresi tarafından onaylanmış protokollere göre gerçekleştirilmiştir. Hayvan atığı malzemelerini atarken atık imha yönetmeliklerine özenle uyun.
1. Fare dermisinin izolasyonu
- 1. Gün
NOT: 1. Günde; Aşağıdaki malzemeleri ve ekipmanları hazırlayın: anestezi odası, hayvan kılı kesme makinesi, izofluran, ince forseps, 0,2 μm şırınga filtreleri.....
Temsili Sonuçlar
Yöntem, kodlama geni her iki alelde de floklanmış ve tamoksifen ile indüklenebilir lenfatik endotelyal spesifik promotör Prox1-CreERT2 18'in etkisi altında silinen küçük bir GTPaz olan RhoA'nın protein ekspresyonunu tanımlamak için geliştirilmiştir. İzole LEC'ler dört nesile kadar kültürlenebilir ve daha sonra yaşlanırlar. Dondurulmuş, çözülmüş ve anjiyopoietin-2 ile başarılı bir şekilde uyarılmıştır. Sınırlı sayıda hücre geçişi nedeniyl.......
Tartışmalar
Lenfatik sistem, vücudun homeostatik fonksiyonunun önemli bir düzenleyicisidir ve en önemli işlevleri sıvı plazmanın korunması, hücresel metabolizma yan ürünlerinin ve toksik moleküllerin uzaklaştırılması, lipid emilimi ve bağışıklık hücresi kaçakçılığıdır 1,19. Uygun belirteçlerin tanımlanması, lenfatik alanda yeni verilerde bir patlamaya neden olmuş ve lenfatik vaskülatürün belirli organların onarımı ve rejeneratif yetene.......
Açıklamalar
Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Bu çalışma, Yunan Araştırma ve Yenilik Vakfı (00376), Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) [Grant R15CA231339], Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi (TTUHSC) Eczacılık Fakültesi Bilimler Ofisi hibesi (CMM'ye) ve Louisiana Monroe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir. Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü [Hibe P20 GM103424-21] aracılığıyla Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) ve Louisiana Mütevelli Heyeti Araştırma Rekabet Edebilirlik Alt Programı (RCS) aracılığıyla Mütevelli Heyeti Destek Fonu (LEQSF(2021-24)-RD-A-23) (GM'ye). Kullanılan yaygın TTUHSC ekipmanı, Teksas Kanser Önleme Araştırma Enstitüsü (C....
Malzemeler
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Syringe Filters | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 100 mm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| 60 mm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Animal Hair Clipper | Wahl | ||
| Antibiotic-Antimycotic Solution 100x | Fisher Scientific | 15240-062 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | 11992-20 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Strainer 40 μm | Fisher Scientific | 542040 | |
| Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 542070 | |
| CO2 Incubator | |||
| Collagen I, High Concentration Rat Tail | Corning | 354249 | dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O |
| Collagenase Type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11-995-073 | |
| DNAse I Solution (2,500 U/mL) | Thermo Scientific | 90083 | |
| Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator | Invitrogen | 120-21D | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | |
| Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium) | R&D Systems | CCM027 | |
| Euthanasia chamber | Euthanex Corporation | ||
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fine Scissors-Sharp | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| FITC anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123107 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads | New England Biolabs | S1432S | |
| LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber | Euthanex Corporation | ||
| MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads | Thermo Scientific | 21356 | |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Rabbit Anti-Mouse LYVE-1 | ReliaTech GmbH | 103-PA50 | |
| Rotating/Shaking Incubator | |||
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Corning | 352063 | |
| Syringe Filters w 0.2 μm Pores | Fisher Scientific | 09-719C | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25-300-120 |
Referanslar
- Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. The lymphatic vasculature in the 21(st) century: novel functional roles in homeostasis and disease. Cell. 182 (2), 270-296 (2020).
- Liu, X., et al.
Yeniden Basımlar ve İzinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır