Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makale, murin endotel hücrelerinin dermal lenfatik kılcal damarlardan manyetik boncuk bazlı izolasyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. İzole edilmiş lenfatik endotel hücreleri, aşağı akış in vitro deneyler ve protein ekspresyon analizi için kullanılabilir.

Özet

Lenfatik sistem, bağışıklık sürveyansı, lipid emilimi ve doku sıvı dengesinin düzenlenmesine katılır. Murin lenfatik endotel hücrelerinin izolasyonu, izole edilen hücreler üzerinde in vitro ve biyokimyasal deneylerin yapılmasına izin verdiği için lenfatik araştırmalar için önemli bir süreçtir. Ayrıca, Cre-lox teknolojisinin gelişimi, küresel olarak hedeflenemeyen genlerin dokuya özgü eksikliğini mümkün kılmış ve incelenen dokulardaki rollerinin kesin olarak belirlenmesine yol açmıştır. Lenfatik fizyoloji ve patofizyolojide belirli genlerin rolünün diseksiyonu, lenfatik spesifik promotörlerin kullanılmasını ve dolayısıyla hedeflenen genlerin ekspresyon seviyelerinin deneysel olarak doğrulanmasını gerektirir.

Lenfatik endotel hücrelerinin vahşi tip veya transgenik farelerden verimli bir şekilde izole edilmesine yönelik yöntemler, lenfatik fonksiyonları düzenleyen mekanizmaları incelemek ve incelenen proteinlerin ekspresyon seviyelerinin tanımlanması için ex vivo ve in vitro tahlillerin kullanılmasını sağlar. LYVE-1 ekspresyonuna dayalı manyetik boncuk saflaştırması yoluyla murin dermal lenfatik endotel hücrelerinin (DLEC'ler) verimli izolasyonu için bir protokol geliştirdik, standartlaştırdık ve sunduk. Ana hatlarıyla belirtilen protokol, araştırmacıları, özellikle floresanla aktive edilen hücre ayırma ekipmanının bulunmadığı tesislerde, lenfatik endotel hücre fonksiyonlarının önemli oyuncularını daha iyi anlamak ve aydınlatmak için bir araçla donatmayı amaçlamaktadır.

Giriş

Lenfatik sistem insan fizyolojisinde çok önemli bir rol oynar. Doku-plazma sıvı dengesinin korunması, immün sürveyans ve lipid emilimi1 gibi önemli işlevlerin yanı sıra kalbin 2 onarım yeteneği ve kemikve hematopoezin rejeneratif kapasitesi gibi yakın zamanda tanımlanan işlevleri kolaylaştıran hayati bir homeostatik faktör olarak kabul edilir3. Lenfatik sistemin önemli rolüne rağmen, lenfatiklerin rolünün çeşitli yönlerinin yanı sıra belirli fizyolojik parametreleri ve yanıtları yöneten moleküler mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. Ayrıca, lenfatik vasküler defektler bazı patofizyolojik durumlarda tetikleyici veya bozucu faktörlerdir. İyi bilinen örnekler, hastalığın genetik veya genetik olmayan kökenine bağlı olarak sırasıyla birincil ve ikincil lenfödemlerdir, lenfatik sistemin birincil tümör büyümesi ve metastatik yayılımı üzerindeki rolü, metastaz için bir kanal ve bağışıklık fonksiyonlarının modülatörü olarak hareket edebileceği için çok önemlidir1.

Kan damar sistemine kıyasla lenfatik çalışma ve bilgideki gecikme, esas olarak kan vasküler sistemi ile karşılaştırıldığında lenfatik sistemin daha sonra keşfedilmesinden ve lenfatik spesifik moleküler belirteçlerin tanımlanmasındaki gecikmeden kaynaklanmaktadır. Bu, son yıllarda büyük ölçüde iyileşmiş ve lenfatiklerin konvansiyonel resminin kararlı durumda ve hastalıklı koşullarda değişmesine yol açmıştır1. Anjiyogeneze benzer şekilde, lenfanjiyogenez, önceden var olanlardan yeni lenfatik damarların oluşmasıdır ve geniş bir hastalık spektrumunun gelişiminde çok önemli bir rol oynar 4,5,6. Bununla birlikte, anjiyogenezden farklı olarak, lenfanjiogenezin araştırılması çoğunlukla patolojik modellerde gelişimsel damar oluşumu ve yapısal bozukluklara odaklanan in vivo modellerle sınırlı kalmıştır. Lenfatik endotel hücrelerinin izolasyonu in vitro çalışmalar için önemlidir ve bu sunulan protokol ile sağlanabilir.

Farelerden lenfatik endotel izolasyonu için floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasının kullanılmasını gerektiren çeşitli protokoller geliştirilmiştir7. Hücre sıralayıcının avantajı, mümkün olduğunda, boncuk bazlı izolasyonun aksine daha yüksek saflık derecesidir ve ikincisi daha yüksek bir verim sağlar. Protokol, lenfatik damarlar 4,8 içindeki hücre trafiği için önemli olan lenfatik endotelyal bir endotel belirteci olan lenfatik endotelyal hyaluronan reseptörü 1'in (LYVE-1) ekspresyonunu kullanır. LYVE-1 ekspresyonu, toplayıcı lenfatik damarlarla değil, lenfatik kılcal damarlarla sınırlı olduğundan, teknik, tüm lenfatik endotel hücrelerinde eşit olarak eksprese edilen podoplanin gibi diğer lenfatik belirteçlerin aksine, lenfatik endotel hücrelerinin spesifik olarak lenfatik kılcal damarlardan izolasyonu için uygundur9. Protokol için, Prox1 gibi transmembran olmayan diğer önemli lenfatik belirteçler hariç tutuldu.

Fizyolojik sonuç genellikle lenfatik kılcal damarlarda başlayan lenfanjiyogenez olduğundan, LYVE-1 bu hücrelerdeki seçiciliği ve seçilen antikorun yüksek verim sağlaması nedeniyle hedef olarak seçildi. Kullanılan enzimler, genellikle kollajen ayrışmasında tip I10'dan daha etkili olduğu bilinen kollajenaz tip II ve dermis-epidermis ayrımı için düzenli olarak kullanılan daha geniş bir proteaz olan dispasidi 11; Bununla birlikte, doku ayrılması için diğer enzimler bildirilmiştir 12,13 ve kullanılabilir. Bu protokolün amacı, özellikle floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasının kolayca bulunamadığı yerlerde, manyetik boncuk saflaştırması kullanılarak yüksek verimle yetişkin farelerin lenfatik kılcal damarlarından dermal lenfatik endotel hücre izolasyonu için bir yöntemi tanımlamaktır. Yöntem, lenfatik endotel hücrelerinin saflığının aşağı akış uygulamaları için tehlikeye atılabileceği uygulamalar için uygundur.

Protokol

Hayvan çalışmaları, TTUHSC'deki deneyler için Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi (TTUHSC) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından ve Patras Üniversitesi'ndeki deneyler için 2010/63 sayılı Direktife göre Batı Yunanistan Valiliği Veterinerlik İdaresi tarafından onaylanmış protokollere göre gerçekleştirilmiştir. Hayvan atığı malzemelerini atarken atık imha yönetmeliklerine özenle uyun.

1. Fare dermisinin izolasyonu

  1. 1. Gün
    NOT: 1. Günde; Aşağıdaki malzemeleri ve ekipmanları hazırlayın: anestezi odası, hayvan kılı kesme makinesi, izofluran, ince forseps, 0,2 μm şırınga filtreleri.
    1. 1x Antibiyotik-Antimikotik Solüsyon ile DMEM'de 2 mg / mL'lik bir Dispas solüsyonu hazırlayın ve filtreyle sterilize edin.
      NOT: Medium veya PBS kullanımı, rapor edilen diğer protokollerde12 başarıyla kullanıldığı için HBSS ile değiştirilebilir. 1x Antibiyotik-Antimikotik Çözelti, penisilin (100 IU / mL), streptomisin (100 μg / mL) ve amfoterisin (2.5 μg / mL) ilavesiyle ikame edilebilir.
    2. Fareyi izofluran uygulaması ile bir anestezi odasına yerleştirerek fareyi uyuşturun (% 0.5-2 izofluran, akış: 1 L / dak). Fare hareket etmeyi bıraktıktan sonra, onu kafesten dışarı aktarın ve benzer bir izofluran akışına sahip bir burun konisini ayarlayarak anesteziye devam edin. Yeterli anestezi seviyelerini doğrulamak için hayvanı ayak parmağınızla sıkıştırın ve derin anestezinin korunduğundan emin olmak için fareyi sürekli izleyin (hareketlilik yok). Bir saç kesme makinesi kullanarak sırt ve ventral kürkün (sırasıyla fare sırtı ve karın) yaklaşık 9cm2'sini orta hat boyunca uzunlamasına klipsleyin. Farenin anesteziden kurtulmasına ve kafese geri dönmesine izin verin.
      NOT: Bunun yerine tüy dökücü (epilasyon) kremi kullanılabilir. Cildin bütünlüğünü korurken izole edilecek cilt bölgelerinde kürkün tamamen çıkarıldığından emin olun. Mümkün olduğunca geniş cilt alanını kırpmaya çalışın. Epilasyondan kaynaklanan potansiyel iltihabın çözüldüğünden emin olmak için, ertesi gün hücre izolasyonu yapılmalıdır. İzole edilmiş hücre havuzlarının sayısını artırmak için grup başına 2 ila 4 fare toplayın.
  2. 2. Gün
    NOT: Aşağıdaki malzeme ve ekipmanları hazır bulundurun: ötenazi odası, biyogüvenlik kabini, CO2 inkübatör, etanol, ince makas, ince forseps, künt forseps, 100 mm doku kültürü plakası, Dispase, DMEM, 1x Antibiyotik-Antimikotik Solüsyon.
    1. Fareyi CO2 uygulamasıyla ötenazi yapın ve kırpılan alanı açığa çıkararak sırtüstü pozisyona getirin. Dezenfektan olarak% 70 etanol püskürtün.
      NOT: Bu adımdan itibaren tüm adımlar steril koşullar altında (biyogüvenlik kabininde) gerçekleştirilmelidir.
    2. Buz üzerine steril 100 mm'lik bir Doku Kültürü Plakası yerleştirin.
    3. Karında 0,5 inçlik yüzeysel bir kesim yapın ve orta hat boyunca boyuna ve alt karın bölgesine uzunlamasına kesin. Cildi kanat çırparak açabilmek için yanal kesimler yapın.
      NOT: Kesi boyutu ve izole edilen cilt alanı fare boyutuna bağlıdır.
    4. Künt forseps kullanarak, cildi çevreleyen dokulardan dikkatlice ayırın. Bunu farenin tüm gövdesinin etrafından dolaşarak yapın, cildi boynun ve alt karın bölgesinin etrafında yanal olarak kesin.
    5. Cildi, dermis tarafı aşağı bakacak şekilde 100 mm'lik Doku Kültürü Plakasına dikkatlice yerleştirin ve cildi mümkün olduğunca gergin tutun. Plakaları örtün ve buz üzerinde tutun. Gruptaki tüm farelerin izolasyonunu tamamlayın.
    6. Deri tüm farelerden çıkarıldıktan sonra, eksplantı düzleştirmek için plakaları oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
    7. Plakaya 6 mL Dispase solüsyonu ekleyin, cildin tamamen daldırıldığından emin olun ve 4 ° C'de hafif çalkalama ile gece boyunca inkübe edin.
      NOT: Dispas yerine, tripsin sindirimi de yapılabilir12, ardından Kollajenaz Tip II tedavisi yerine Liberaz (aşağıda).

2. Dermisten hücre izolasyonu

  1. 3. Gün
    NOT: Aşağıdaki malzeme ve ekipmanları hazır bulundurunuz: santrifüj, CO2 inkübatör, biyogüvenlik kabini, makas, DMEM, 1x Antibiyotik-Antimikotik Solüsyon, Kollajenaz Tip II, PBS, 50 mL konik tüp, 100 mm ve 60 mm doku kültürü plakaları, DNAse I solüsyonu, Kollajen Tip I, 70 μm ve 40 μm hücre süzgeçleri, 0.2 μm şırınga filtreleri, LEC ortamı.
    1. 500 mL 1x PBS (1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4, pH 7.4) hazırlayın ve 15 psi'de 20 dakika otoklavlayın veya filtreyle sterilize edin. Alternatif olarak, piyasada bulunan steril PBS'yi kullanın.
    2. 1x Antibiyotik-Antimikotik Çözelti ile DMEM'de 10 mL 2 mg / mL Kollajenaz Tip II çözeltisi hazırlayın ve filtreyle sterilize edin.
      NOT: Numune kontaminasyonu olasılığını azaltmak için sonraki adımları steril bir başlık altında gerçekleştirin.
    3. Sıvıyı tabaktan çıkarmak için bir pipet kullanın.
    4. Dermisi (derinin alt kısmı) epidermisten (üst) ayırmak için forseps kullanın ve belirgin yağ dokusunu çıkarın. Dermisi temiz bir Doku Kültürü plakasına aktarın.
    5. Temiz Doku Kültürü Plakasına 1x Antibiyotik-Antimikotik Solüsyon ile 1 mL DMEM ekleyin ve sıvının plakanın bir tarafında birikmesi için eğin.
    6. Dermisi 1-2 mm'lik2 parçaya doğrayın ve 50 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın.
      NOT: Bu adım ideal olarak 4-5 dakika içinde tamamlanmalıdır, çünkü daha uzun işlemenin daha yüksek verim veya hücre sağkalımı sağlaması beklenmemektedir.
    7. 10 mL Kollajenaz Tip II çözeltisi ekleyin.
    8. 50 μL (25 birim / mL çözelti) DNAse I çözeltisi ekleyin (hücre topaklanmasını azaltır) ve dermis çözeltisini sürekli çalkalama ile 37 ° C'de 2 saat sindirin (30-50 rpm'de dönen / sallanan bir inkübatör kullanın).
      NOT: Dermisin çoğunun sindirilip sindirilmediğini belirlemek için periyodik olarak kontrol edin. Değilse, sindirim süresini (en fazla 1 saat) ve mümkünse çalkalama hızını artırın.
    9. 60 mm Doku Kültürü Plakalarını 2 mL 10 μg/mL Kollajen Tip I ile 0.02 M Asetik Asit içinde 37 °C'de >20 dakika kaplayın. 2x'i steril PBS ile yıkayın.
    10. Hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak süzün ve 250 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
    11. 1x Antibiyotik-Antimikotik Çözelti ile 10 mL DMEM'de tekrar süspanse edin.
    12. Hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak süzün ve 250 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
    13. 1 mL tam LEC ortamında (Takviyeli Endotel Hücre Büyüme Baz Ortamı) yeniden süspanse edin.
    14. Kollajen kaplı 60 mm Doku Kültürü Plakasındaki hücreleri tam LEC ortamında plakalayın. Bu, hücre kültürünün 0. günü olacak.
    15. Hücreleri her 2 günde bir iki kez 1x PBS ile yıkayarak ve taze LEC ortamı ekleyerek ortamı değiştirin.
    16. Hücreler %80-90 birleşene kadar 2.1.15 adımını tekrarlayın.
      NOT: Saflaştırma, hücreler %80-90 birleşmeden önce gerçekleştirilirse, daha az lenfatik endotel hücresi izole edilecektir. Bu işlem yaklaşık 7 ila 10 gün sürer.

3. LYVE-1 antikoru ile Manyetik Boncuk Kaplama

NOT: Saflaştırma adımından bir gün önce aşağıdaki malzeme ve ekipmanları hazırlayın: 4 °C Buzdolabı, Rotor, manyetik ayırıcı, PBS, Anti-Tavşan IgG Manyetik Boncuklar, mikrosantrifüj tüpleri, 0.2 μm şırınga filtreleri, Manyetik Boncuk Kaplama Çözeltisi, LYVE-1 antikoru.

  1. Manyetik Boncuk Kaplama Solüsyonunu hazırlayın:% 0.1 BSA ve 2 mM EDTA ile 20 mL PBS ve filtre ile sterilize edin. 4 °C'de saklayın.
    NOT: Birkaç günden fazla depolama önerilir; Kullanmadan önce çökelti veya kirlenme olup olmadığını kontrol edin.
  2. 500 μL Anti-Tavşan IgG Manyetik Boncukları bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin ve 1 mL buz gibi soğuk Manyetik Boncuk Kaplama Çözeltisi ekleyin.
  3. Boncukları yıkamak için manyetik bir ayırıcı kullanın.
  4. Buz gibi soğuk Manyetik Boncuk Kaplama Solüsyonu ile 1 mL yıkamayı 2 kez tekrarlayın.
  5. Boncukları 500 μL Manyetik Boncuk Kaplama Çözeltisi içinde yeniden süspanse edin ve mikrosantrifüj tüplerinde 150 μL'lik alikotlar yapın.
  6. Her tüpe 15 μg LYVE-1 antikoru ekleyin (1 mg / mL antikor stok konsantrasyonundan 15 μL).
  7. Sürekli çalkalama ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.

4. Lenfatik endotel hücre saflaştırması

NOT: Aşağıdaki malzeme ve ekipmanları hazırlayın: CO2 inkübatör, çalkalayıcı, zamanlayıcı, parafilm, DMEM, 1x Antibiyotik-Antimikotik Solüsyon, BSA, PBS, Manyetik Boncuk Kaplama Solüsyonu, tripsin-EDTA, 100 mm veya 60 mm doku kültürü plakaları, 0.2 μm şırınga filtreleri, Kollajen Tip I, Asetik asit, LEC ortamı.

  1. 1x Antibiyotik-Antimikotik Çözelti ve% 0.1 BSA ile 50 mL DMEM hazırlayın ve filtreyle sterilize edin.
  2. 60 mm Doku Kültürü Plakalarını 10 μg/mL Kollajen Tip I ile 0,02 M Asetik Asit içinde 37 °C'de >20 dakika kaplayın. 2x'i steril PBS ile yıkayın.
  3. Önceden kaplanmış boncukları manyetik bir ayırıcı kullanarak 1 mL Manyetik Boncuk Kaplama Solüsyonu ile yıkayın.
  4. Boncukları% 0.1 BSA ile 150 μL DMEM'de yeniden süspanse edin.
    NOT: Boncuklar artık 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir.
  5. Hücreleri PBS ile 2 kez yıkayın.
  6. Hücrelere %0.1 BSA (60 mm Doku Kültürü Plakası için) ile 3 mL DMEM ve 50 μL antikor konjuge boncuk ekleyin.
    NOT: İki veya daha fazla fareden alınan hücreler toplanırsa, 100 mm'lik bir Doku Kültürü Plakası kullanın ve% 0.1 BSA ile 6 mL DMEM ekleyin.
  7. Çanağı parafilm ile kapatın.
  8. Çanağı RT'de 10 RPM'de çalkalayan bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve tam olarak 10 dakika inkübe edin.
    NOT: Daha uzun inkübasyon, spesifik olmayan bağlanmaya neden olacaktır. Boncukların tüm plaka yüzeyi ile etkileşime girmesini sağlamak için, sallanmaya devam ederken plakayı birkaç dakikada bir manuel olarak döndürün.
  9. Ortamı atın ve hücreleri PBS ile bir kez yıkayın. Plaka üzerinde LEC kolonilerinin varlığını doğrulamak için hücreleri hızlı bir şekilde inceleyin.
  10. Hücreleri tripsinize edin: 1 mL tripsin-EDTA kullanın ve 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin. Hücrelerde başarılı hücre ayrılması olup olmadığını kontrol edin.
  11. Çözeltiyi 2 mL tam LEC ortamı ile nötralize edin ve çözeltiyi 5 mL steril polipropilen tüpe aktarın.
  12. Manyetik bir ayırıcı kullanarak, bağlanmamış hücreleri çıkarmak için 4 x 3 mL DMEM'i %0.1 BSA ile yıkayın.
  13. Kalan boncuk bağlı hücreleri tam LEC ortamında yeniden süspanse edin ve daha önce Kollajen kaplı 60 mm Doku Kültürü Plakaları üzerine plakalayın.
  14. Hücreleri 37 ° C'de inkübe edin ve her seferinde iki PBS yıkamadan sonra ortamı her gün değiştirin.
  15. Hücreleri birleşene kadar kültürleyin (normalde 7 ila 10 gün sürer).
  16. Bu noktada, mikroskop altında hücreleri birleşme açısından kontrol edin ve hücreleri akış sitometrisi için hazırlamaya devam edin. Yüksek bir F4 / 80+ yüzdesi tanımlanırsa, saflaştırma adımını LYVE-1 (Adım 4: Lenfatik Endotel Hücre Saflaştırması) veya ideal olarak başka bir lenfatik belirteç (yani, podoplanin14) ile tekrarlayın.
    NOT: Manyetik boncuk saflaştırılmış hücre popülasyonu üzerindeki antikor tarafından hedeflenen proteinin yüksek ekspresyonu gösterilmiştir15,16. Bununla birlikte, LYVE-1 için, çoğunlukla makrofajlar olmak üzere diğer LYVE-1+ hücrelerinin yüzdesinin tanımlanması için bir akış sitometrisi kontrolü yapmak önemlidir. LYVE-1 sadece tümörler ve yaralarla ilişkili makrofaj alt kümelerinde eksprese edilirken, sağlıklı ciltte LYVE-1 ekspresyonu lenfatik endotel hücreleri17 ile daha sınırlıdır. Bu nedenle, F4/80 taraması zorunlu değildir, daha çok deneysel bağlama bağlıdır. Gösteri için kullanılan fareler tümör veya yara taşımıyordu, sadece epilasyondan kaynaklanan potansiyel iltihaplanma taşıyordu, ancak LYVE-1 + makrofajların yüzdesinin bir temeli olarak F4 / 80 boyamasını dahil ettik.

5. Akış sitometrisi

NOT: Aşağıdaki malzeme ve ekipmanları hazırlayın: santrifüj, CO2 inkübatör, zamanlayıcı, hemositometre, EDTA çözeltisi, 1x Antibiyotik-Antimikotik Çözelti, BSA, PBS, tripsin-EDTA, polipropilen tüpler, 0.2 μm şırınga filtreleri, %70 etanol, F4/80 FITC konjuge antikor.

  1. % 0.1 BSA içeren PBS'yi hazırlayın ve filtreyle sterilize edin.
  2. PBS'de 1 mM EDTA çözeltisi hazırlayın.
  3. Hücreleri tripsinize edin: hücreleri 1 mL 1 mM EDTA çözeltisi ile 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
    NOT: EDTA çözeltisi ile inkübasyon, transmembran proteinleri daha iyi koruyan ve tercih edilen daha hafif bir hücre ayrılması yöntemidir, ancak daha uzun inkübasyon süreleri gerektirir. Alternatif olarak, tripsin-EDTA çözeltisi 37 ° C'de 1 dakikalık inkübasyon için kullanılabilir, ancak bu, akış sitometrisi uygulamaları için antikor afinitesini etkileyebilir.
  4. Çözeltiyi 2 mL tam LEC ortamı ile nötralize edin ve çözeltiyi 5 mL steril polipropilen tüpe aktarın.
  5. Numuneleri 250 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  6. PBS ile yıkayın.
  7. Santrifüjlemeyi ve PBS yıkamasını tekrarlayın.
  8. % 0.1 BSA içeren PBS'deki hücreleri yeniden süspanse edin ve bunları bir hemositometre veya alternatif bir yöntem kullanarak sayın. Nihai hacmi 100 μl olan polipropilen tüplere ~ 1 ×10 6 hücre ekleyin. Bu adımdan itibaren tüm adımları 4 °C'de gerçekleştirin.
    NOT: Hücreler lekelenmeden önce sabitlenebilir veya canlıyken lekelenebilir. Fiksasyon, akış sitometrisi için yetersiz olabilir, çünkü bazı antikorlar fiksasyondan sonra antijenleri tespit edemeyebilir; Bu nedenle, önceki adımdan hemen sonra akış sitometrisini çalıştırmanızı ve fiksasyon adımını atlamanızı öneririz. Bu mümkün değilse, akış sitometrisi deneyinden önce fiksasyon, akış sitometrisi adımında bir gecikmeye izin verecektir. Fiksasyon yapılacaksa, antikorların sabit hücreler bağlamındaki performansı önceden değerlendirilmelidir.
  9. Fiksasyon yapın (isteğe bağlı adım; hücreler sabitlenmeyecekse, immün boyama ile devam edin): hücreleri buz gibi% 70 etanolde yeniden süspanse edin ve buz üzerinde 10 dakika boyunca hafifçe karıştırın.
    NOT: Etanol fiksasyonu hücrelere nüfuz edebilir ve GFP'nin salınmasına neden olabilir; Bununla birlikte, paraformaldehit bazlı fiksasyon, akış sitometrisi için kullanılan boyaları yok edebilir ve ideal olarak önlenebilir.
  10. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
  11. Hücreleri 2x PBS'de 250 × g'da 5 dakika santrifüjleme ile 1x yıkayın.
  12. Bir sonraki adıma geçin veya hücreleri 0,5-1 mL 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de saklayın.

6. İmmün boyama

NOT: Hücre zarı bütünlüğünü korumak ve hücre ölümünü en aza indirmek için hücreleri nazikçe tutun ve mümkün olduğunda kapsamlı pipetlemeden kaçının, böylece hücrelerin kümeler oluşturmadığından emin olun. İzole edilmiş endotel hücrelerinden aşağıdaki grupları hazırlayın: boyanmamış hücreler ve başka bir endotel hücre markörü (yani, VEGFR3, podoplanin), F4 / 80 ve her ikisi ile boyanmış hücreler. Ticari olarak temin edilebilen fare lenfatik endotel hücrelerini ve varsa makrofajları pozitif kontroller olarak dahil edin. Gösteri amaçlı ve endojen tdTomato floresansı (PE +) nedeniyle, FITC konjuge F4 / 80 boyama kullandık.

  1. PBS'deki birincil antikoru, önerilen veya optimize edilmiş seyreltmeye göre% 0.1 BSA ile seyreltin. Hücre süspansiyonunun 100 μL'sine F4/80 FITC konjuge antikorun 0.5 μg (1 μL antikor çözeltisi) ekleyin.
  2. Seyreltilmiş floresan konjuge antikorun eklenmesinden sonra hücreleri yeniden süspanse edin. Topak olmadığından ve tüm hücrelerin uygun şekilde kaplandığından emin olmak için polipropilen tüpü hafifçe vurarak karıştırın.
  3. Oda sıcaklığında (sabit hücreler) 1 saat veya karanlıkta buz üzerinde (canlı hücreler) 30 dakika inkübe edin.
  4. Hücreleri 250 × g'da 4 °C'de (canlı hücreler için) veya oda sıcaklığında (sabit hücreler için) 5 dakika santrifüj ederek, karanlıkta %0,1 BSA'lı PBS kullanarak yıkayın.
  5. Floresan konjuge olmayan antikorlar için
    1. Florokrom konjuge ikincil antikoru inkübasyon tamponunda seyreltin. Alexa Flour antikorları için 1:500 seyreltme kullanın.
    2. İkincil antikoru 100 μL hücre süspansiyon çözeltisine ekleyin.
    3. Oda sıcaklığında (sabit hücreler) veya buz üzerinde (canlı hücreler) 30 dakika inkübe edin.
    4. İnkübasyon tamponunda 4 ° C'de (canlı hücreler için) veya oda sıcaklığında (sabit hücreler için) 5 dakika boyunca 250 × g'da santrifüjleme ile iki kez yıkayın.
  6. Hücreleri 0.5 mL 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve bunları bir akış sitometresi kullanarak analiz edin.
  7. LYVE-1 eksprese eden hücreler içindeki makrofaj popülasyonunu tanımlamak için bu geçit stratejisi adımlarını izleyin:
    1. Hücresel popülasyonu ayırt etmek için ileri ve yan saçılmayı düşünün.
    2. Tek hücreleri ayırt etmek için hücre boyutu, alan ve yükseklik için ileri saçılmayı göz önünde bulundurun (Singlets).
    3. TdTomato (PE) eksprese eden izole fare hücreleri içindeki makrofajları (F4/80+) tanımlamak için F4/80 (FITC) ekspresyonunu ve RFP (PE) ekspresyonunu dikkate alın (aşağıda açıklanan spesifik farelerde bir floresan tdTomato raportörünün varlığından dolayı).

Sonuçlar

Yöntem, kodlama geni her iki alelde de floklanmış ve tamoksifen ile indüklenebilir lenfatik endotelyal spesifik promotör Prox1-CreERT2 18'in etkisi altında silinen küçük bir GTPaz olan RhoA'nın protein ekspresyonunu tanımlamak için geliştirilmiştir. İzole LEC'ler dört nesile kadar kültürlenebilir ve daha sonra yaşlanırlar. Dondurulmuş, çözülmüş ve anjiyopoietin-2 ile başarılı bir şekilde uyarılmıştır. Sınırlı sayıda hücre geçişi nedeniyl...

Tartışmalar

Lenfatik sistem, vücudun homeostatik fonksiyonunun önemli bir düzenleyicisidir ve en önemli işlevleri sıvı plazmanın korunması, hücresel metabolizma yan ürünlerinin ve toksik moleküllerin uzaklaştırılması, lipid emilimi ve bağışıklık hücresi kaçakçılığıdır 1,19. Uygun belirteçlerin tanımlanması, lenfatik alanda yeni verilerde bir patlamaya neden olmuş ve lenfatik vaskülatürün belirli organların onarımı ve rejeneratif yetene...

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Yunan Araştırma ve Yenilik Vakfı (00376), Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) [Grant R15CA231339], Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi (TTUHSC) Eczacılık Fakültesi Bilimler Ofisi hibesi (CMM'ye) ve Louisiana Monroe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir. Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü [Hibe P20 GM103424-21] aracılığıyla Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) ve Louisiana Mütevelli Heyeti Araştırma Rekabet Edebilirlik Alt Programı (RCS) aracılığıyla Mütevelli Heyeti Destek Fonu (LEQSF(2021-24)-RD-A-23) (GM'ye). Kullanılan yaygın TTUHSC ekipmanı, Teksas Kanser Önleme Araştırma Enstitüsü (CPRIT) Hibe RP190524 ve RP200572 aracılığıyla elde edildi. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımında, yazma kararında veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu. Şekil 1A'daki grafiksel özet BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm Syringe FiltersFisher Scientific09-719C
100 mm Tissue Culture DishesFisher ScientificFB012924
60 mm Tissue Culture DishesFisher ScientificFB012921
Animal Hair ClipperWahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100xFisher Scientific15240-062
Blunt ForcepsFine Science Tools11992-20
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA4919
Cell Strainer 40 μmFisher Scientific542040
Cell Strainer 70 μmFisher Scientific542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat TailCorning354249dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O
Collagenase Type IILife Technologies17101-015
DispaseLife Technologies17105-041
DMEMFisher Scientific11-995-073
DNAse I Solution (2,500 U/mL)Thermo Scientific90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle ConcentratorInvitrogen120-21D
EDTASigma-Aldrich3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium)R&D SystemsCCM027
Euthanasia chamberEuthanex Corporation
Fine ForcepsFine Science Tools11255-20
Fine Scissors-SharpFine Science Tools14060-10
FITC anti-mouse F4/80 AntibodyBiolegend123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic BeadsNew England BiolabsS1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction ChamberEuthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG BeadsThermo Scientific21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBSFisher ScientificAAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1ReliaTech GmbH103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene TubesCorning352063
Syringe Filters w 0.2 μm PoresFisher Scientific09-719C
Trypsin-EDTAFisher Scientific25-300-120

Referanslar

  1. Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. The lymphatic vasculature in the 21(st) century: novel functional roles in homeostasis and disease. Cell. 182 (2), 270-296 (2020).
  2. Liu, X., et al. Lymphoangiocrine signals promote cardiac growth and repair. Nature. 588 (7839), 705-711 (2020).
  3. Biswas, L., et al. Lymphatic vessels in bone support regeneration after injury. Cell. 186 (2), 382-397 (2023).
  4. Tammela, T., Alitalo, K. Lymphangiogenesis: molecular mechanisms and future promise. Cell. 140 (4), 460-476 (2010).
  5. Ji, R. C. The role of lymphangiogenesis in cardiovascular diseases and heart transplantation. Heart Failure Reviews. 27 (5), 1837-1856 (2022).
  6. Patnam, M., et al. Lymphangiogenesis guidance mechanisms and therapeutic implications in pathological states of the cornea. Cells. 12 (2), 319 (2023).
  7. Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52691 (2015).
  8. Jackson, D. G. Biology of the lymphatic marker LYVE-1 and applications in research into lymphatic trafficking and lymphangiogenesis. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 112 (7-8), 526-538 (2004).
  9. Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes and Development. 19 (3), 397-410 (2005).
  10. Wolters, G. H., Vos-Scheperkeuter, G. H., Lin, H. C., van Schilfgaarde, R. Different roles of class I and class II Clostridium histolyticum collagenase in rat pancreatic islet isolation. Diabetes. 44 (2), 227-233 (1995).
  11. Kubo, A., Aoki, S., Fujita, H. Whole-mount preparation and microscopic analysis of epidermis. Current Protocols. 2 (7), e464 (2022).
  12. Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
  13. Kazenwadel, J., Michael, M. Z., Harvey, N. L. Prox1 expression is negatively regulated by miR-181 in endothelial cells. Blood. 116 (13), 2395-2401 (2010).
  14. Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
  15. Choi, E. Y., et al. Del-1, an endogenous leukocyte-endothelial adhesion inhibitor, limits inflammatory cell recruitment. Science. 322 (5904), 1101-1104 (2008).
  16. Mikelis, C. M., et al. RhoA and ROCK mediate histamine-induced vascular leakage and anaphylactic shock. Nature Communications. 6, 6725 (2015).
  17. Schledzewski, K., et al. Lymphatic endothelium-specific hyaluronan receptor LYVE-1 is expressed by stabilin-1+, F4/80+, CD11b+ macrophages in malignant tumours and wound healing tissue in vivo and in bone marrow cultures in vitro: implications for the assessment of lymphangiogenesis. Journal of Pathology. 209 (1), 67-77 (2006).
  18. Akwii, R. G., et al. Angiopoietin-2-induced lymphatic endothelial cell migration drives lymphangiogenesis via the beta1 integrin-RhoA-formin axis. Angiogenesis. 25 (3), 373-396 (2022).
  19. Petrova, T. V., Koh, G. Y. Biological functions of lymphatic vessels. Science. 369 (6500), eaax4063 (2020).
  20. Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 453-458 (2003).
  21. Mellor, R. H., et al. Lymphatic dysfunction, not aplasia, underlies Milroy disease. Microcirculation. 17 (4), 281-296 (2010).
  22. Connell, F., Brice, G., Mortimer, P. Phenotypic characterization of primary lymphedema. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 140-146 (2008).
  23. Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. Journal of Pediatris. 164 (2), 383-388 (2014).
  24. Ji, Y., Chen, S., Peng, S., Xia, C., Li, L. Kaposiform lymphangiomatosis and kaposiform hemangioendothelioma: similarities and differences. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 165 (2019).
  25. Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. Journal of Experimental Medicine. 194 (6), 797-808 (2001).
  26. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  27. Garrafa, E., et al. Isolation, purification, and heterogeneity of human lymphatic endothelial cells from different tissues. Lymphology. 38 (4), 159-166 (2005).
  28. Kazenwadel, J., Secker, G. A., Betterman, K. L., Harvey, N. L. In vitro assays using primary embryonic mouse lymphatic endothelial cells uncover key roles for FGFR1 signalling in lymphangiogenesis. PLoS One. 7 (7), e40497 (2012).
  29. Steele, M. M., et al. T cell egress via lymphatic vessels is tuned by antigen encounter and limits tumor control. Nature Immunology. 24 (4), 664-675 (2023).
  30. Mammoto, T., et al. Effects of age-dependent changes in cell size on endothelial cell proliferation and senescence through YAP1. Aging. 11 (17), 7051-7069 (2019).
  31. Regina, C., et al. Vascular ageing and endothelial cell senescence: Molecular mechanisms of physiology and diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 159, 14-21 (2016).
  32. Muhleder, S., Fernandez-Chacon, M., Garcia-Gonzalez, I., Benedito, R. Endothelial sprouting, proliferation, or senescence: tipping the balance from physiology to pathology. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (4), 1329-1354 (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler Murin Dermal Lenfatik Endotel H creleriManyetik Boncuk Tabanl zolasyonLYVE 1 EkspresyonuLenfatik Endotel H cre FizyolojisiLenfatik SistemCre lox TeknolojisiLenfatik Spesifik Promot rlerLenfatik FonksiyonlarLenfatik Ara t rmaEx Vivo Ve n Vitro Deneyler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır