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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo articolo descrive un metodo per l'isolamento basato su biglie magnetiche di cellule endoteliali murine dai capillari linfatici dermici. Le cellule endoteliali linfatiche isolate possono essere utilizzate per esperimenti in vitro a valle e per l'analisi dell'espressione proteica.

Abstract

Il sistema linfatico partecipa alla regolazione della sorveglianza immunitaria, dell'assorbimento dei lipidi e dell'equilibrio dei liquidi tissutali. L'isolamento delle cellule endoteliali linfatiche murine è un processo importante per la ricerca linfatica, in quanto consente l'esecuzione di esperimenti in vitro e biochimici sulle cellule isolate. Inoltre, lo sviluppo della tecnologia Cre-lox ha permesso la carenza tessuto-specifica di geni che non possono essere bersagliati a livello globale, portando alla determinazione precisa del loro ruolo nei tessuti studiati. La dissezione del ruolo di alcuni geni nella fisiologia linfatica e nella fisiopatologia richiede l'uso di promotori linfatici-specifici e, quindi, la verifica sperimentale dei livelli di espressione dei geni bersaglio.

I metodi per l'isolamento efficiente di cellule endoteliali linfatiche da topi wild-type o transgenici consentono l'uso di saggi ex vivo e in vitro per studiare i meccanismi che regolano le funzioni linfatiche e l'identificazione dei livelli di espressione delle proteine studiate. Abbiamo sviluppato, standardizzato e presentato un protocollo per l'isolamento efficiente di cellule endoteliali linfatiche dermiche murine (DLEC) tramite purificazione con biglie magnetiche basato sull'espressione di LYVE-1. Il protocollo delineato mira a fornire ai ricercatori uno strumento per comprendere e chiarire ulteriormente gli attori importanti delle funzioni delle cellule endoteliali linfatiche, in particolare nelle strutture in cui non sono disponibili apparecchiature di smistamento cellulare attivate dalla fluorescenza.

Introduzione

Il sistema linfatico svolge un ruolo fondamentale nella fisiologia umana. È considerato un fattore omeostatico vitale, che facilita funzioni importanti, come il mantenimento dell'equilibrio dei fluidi tissutali-plasmatici, la sorveglianza immunitaria e l'assorbimento dei lipidi1, nonché funzioni recentemente identificate, come la capacità di riparazione del cuore2 e la capacità rigenerativa dell'osso e l'emopoiesi3. Nonostante il ruolo significativo del sistema linfatico, diversi aspetti del ruolo dei linfatici, così come i meccanismi molecolari che governano alcuni parametri fisiologici e le risposte, rimangono sfuggenti. Inoltre, i difetti vascolari linfatici sono fattori scatenanti o deterioranti in determinate condizioni fisiopatologiche. Esempi ben noti sono i linfedemi primari e secondari, a seconda dell'origine genetica o non genetica della malattia, rispettivamente, mentre il ruolo del sistema linfatico sulla crescita del tumore primario e sulla disseminazione metastatica è fondamentale, in quanto può fungere da condotto per le metastasi e modulatore delle funzioni immunitarie1.

Il ritardo nello studio e nella conoscenza del sistema linfatico rispetto al sistema vascolare del sangue è dovuto principalmente alla successiva scoperta del sistema linfatico rispetto al sistema vascolare del sangue e al ritardo nell'identificazione di marcatori molecolari linfatico-specifici. Questo è notevolmente migliorato negli ultimi decenni, portando all'alterazione del quadro convenzionale dei linfatici allo stato stazionario e in condizioni di malattia1. Analogamente all'angiogenesi, la linfangiogenesi è la formazione di nuovi vasi linfatici da quelli preesistenti e svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo di un ampio spettro di malattie 4,5,6. Tuttavia, a differenza dell'angiogenesi, lo studio della linfangiogenesi è stato limitato a modelli per lo più in vivo, concentrandosi sulla formazione dei vasi di sviluppo e sui difetti strutturali in modelli patologici. L'isolamento delle cellule endoteliali linfatiche è importante per gli studi in vitro e questo può essere fornito dal protocollo presentato.

Sono stati sviluppati diversi protocolli per l'isolamento dell'endotelio linfatico dai topi, che richiedono l'uso della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza7. Il vantaggio del selezionatore cellulare, ove disponibile, è il grado di purezza più elevato, contrariamente all'isolamento basato su microsfere, con quest'ultimo che fornisce una resa maggiore. Il protocollo utilizza l'espressione del recettore 1 dell'acido ialuronico endoteliale linfatico (LYVE-1), un marcatore endoteliale linfatico, importante per il traffico cellulare all'interno dei vasi linfatici 4,8. Poiché l'espressione di LYVE-1 è limitata ai capillari linfatici e non ai vasi linfatici collettori, la tecnica è adatta per l'isolamento delle cellule endoteliali linfatiche specificamente dai capillari linfatici, contrariamente ad altri marcatori linfatici, come la podoplanina, che sono espressi uniformemente in tutte le cellule endoteliali linfatiche9. Per il protocollo, sono stati esclusi altri importanti marcatori linfatici che non erano transmembrana, come Prox1.

Poiché l'esito fisiologico era la linfangiogenesi, che di solito inizia a livello dei capillari linfatici, LYVE-1 è stato selezionato come bersaglio a causa della sua selettività in queste cellule e perché l'anticorpo selezionato forniva un'elevata resa. Gli enzimi utilizzati erano la collagenasi di tipo II, che è generalmente nota per essere più efficace nella dissociazione del collagene rispetto al tipoI 10, e la dispasi, una proteasi più ampia, regolarmente utilizzata per la separazione derma-epidermide11; Tuttavia, sono stati riportati altri enzimi per la separazione dei tessuti12,13 e possono essere utilizzati. L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un metodo per l'isolamento delle cellule endoteliali linfatiche dermiche dai capillari linfatici di topi adulti con alta resa utilizzando la purificazione con biglie magnetiche, specialmente in luoghi in cui la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza non è prontamente disponibile. Il metodo è adatto per applicazioni in cui la purezza delle cellule endoteliali linfatiche può essere compromessa per le applicazioni a valle.

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Protocollo

Gli studi sugli animali sono stati eseguiti secondo i protocolli approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Texas Tech University Health Sciences Center (TTUHSC) per gli esperimenti presso il TTUHSC e dall'Amministrazione veterinaria della Prefettura della Grecia occidentale secondo la direttiva 2010/63 per gli esperimenti presso l'Università di Patrasso. Seguire diligentemente le norme sullo smaltimento dei rifiuti durante lo smaltimento dei materiali di scarto animale.

1. Isolamento del derma di topo

  1. Giorno 1
    NOTA: Il giorno 1; Prepara i seguenti materiali e attrezzature: camera per anestesia, tagliacapelli per animali, isoflurano, pinze fini, filtri per siringhe da 0,2 μm.
    1. Preparare una soluzione di dispasi da 2 mg/mL in DMEM con 1x soluzione antibiotico-antimicotica e sterilizzarla con filtro.
      NOTA: L'uso del mezzo o del PBS può essere sostituito da HBSS, poiché è stato utilizzato con successo in altri protocolli segnalati12. La soluzione antibiotico-antimicotica 1x può essere sostituita con l'aggiunta di penicillina (100 U.I./mL), streptomicina (100 μg/mL) e amfotericina (2,5 μg/mL).
    2. Anestetizzare il topo posizionandolo in una camera di anestesia con somministrazione di isoflurano (0,5-2% di isoflurano, flusso: 1 L/min). Dopo che il topo ha smesso di muoversi, trasferirlo fuori dalla gabbia e continuare l'anestesia regolando un cono nasale con un flusso di isoflurano simile. Pizzicare l'animale per confermare livelli di anestesia sufficienti e monitorare costantemente il topo per assicurarsi che l'anestesia profonda sia preservata (nessuna motilità). Tagliare circa 9 cm2 del pelo dorsale e ventrale (rispettivamente dorso e addome del topo) longitudinalmente lungo la linea mediana, utilizzando un tagliacapelli. Lascia che il topo si riprenda dall'anestesia e rimettilo nella gabbia.
      NOTA: In alternativa è possibile utilizzare una crema per la depilazione (depilazione). Assicurarsi che il pelo sia completamente rimosso nelle zone cutanee da isolare mantenendo l'integrità della pelle. Cerca di tagliare l'area della pelle il più estesa possibile. Per garantire che la potenziale infiammazione derivante dalla depilazione venga risolta, l'isolamento delle cellule deve avvenire il giorno successivo. Per aumentare il numero di cellule isolate, raggruppare da 2 a 4 topi per gruppo.
  2. Giorno 2
    NOTA: Tenere a portata di mano i seguenti materiali e attrezzature: camera per eutanasia, armadio di biosicurezza, incubatore per CO2 , etanolo, forbici fini, pinze fini, pinze smussate, piastra per colture tissutali da 100 mm, Dispase, DMEM, 1x soluzione antibiotico-antimicotica.
    1. Sopprimere il topo mediante somministrazione di CO2 e posizionarlo in posizione supina, esponendo l'area tagliata. Spruzzare etanolo al 70% come disinfettante.
      NOTA: Da questo passaggio in poi, tutti i passaggi devono essere eseguiti in condizioni sterili (in una cappa di biosicurezza).
    2. Posizionare una piastra sterile per colture tissutali da 100 mm sul ghiaccio.
    3. Fai un taglio superficiale di 0,5 pollici sull'addome e taglia longitudinalmente lungo la linea mediana fino al collo e al basso addome. Fai dei tagli laterali per poter aprire la pelle.
      NOTA: La dimensione dell'incisione e l'area cutanea isolata dipendono dalle dimensioni del topo.
    4. Usando una pinza smussata, separa accuratamente la pelle dai tessuti circostanti. Fallo girando intorno all'intero busto del topo, tagliando la pelle lateralmente intorno al collo e al basso addome.
    5. Posizionare con cautela la pelle nella piastra di coltura tissutale da 100 mm, con il lato del derma rivolto verso il basso, mantenendo la pelle il più tesa possibile. Coprite i piatti e teneteli in ghiaccio. Completa l'isolamento di tutti i topi del gruppo.
    6. Dopo che la pelle è stata estratta da tutti i topi, incubare le piastre per 10 minuti a temperatura ambiente per appiattire l'espianto.
    7. Aggiungere 6 mL di soluzione di Dispase alla piastra, assicurandosi che la pelle sia completamente immersa e incubare per una notte con una leggera agitazione a 4 °C.
      NOTA: Invece della Dispasi, si può eseguire anche la digestione della tripsina12, seguita dal trattamento con Liberase invece della Collagenasi di tipo II (sotto).

2. Isolamento cellulare dal derma

  1. Giorno 3
    NOTA: Tenere a portata di mano i seguenti materiali e attrezzature: centrifuga, incubatore di CO2 , cappa di biosicurezza, forbici, DMEM, 1 soluzione antibiotico-antimicotica, collagenasi di tipo II, PBS, provetta conica da 50 mL, piastre per colture tissutali da 100 mm e 60 mm, soluzione di DNAsi I, collagene di tipo I, filtri cellulari da 70 μm e 40 μm, filtri per siringhe da 0,2 μm, terreno LEC.
    1. Preparare 500 mL di 1x PBS (1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4, pH 7,4) e sterilizzare in autoclave per 20 minuti a 15 psi o sterilizzare con filtro. In alternativa, utilizzare PBS sterile disponibile in commercio.
    2. Preparare 10 mL di soluzione di Collagenasi di Tipo II da 2 mg/mL in DMEM con 1x Soluzione Antibiotico-Antimicotica e sterilizzarla con filtro.
      NOTA: Eseguire i passaggi successivi sotto una cappa sterile per ridurre le possibilità di contaminazione del campione.
    3. Utilizzare una pipetta per rimuovere il liquido dal piatto.
    4. Usa una pinza per separare il derma (parte inferiore della pelle) dall'epidermide (parte superiore) e rimuovere qualsiasi tessuto adiposo evidente. Trasferire il derma su una piastra di coltura tissutale pulita.
    5. Aggiungere 1 mL di DMEM con 1x Soluzione antibiotico-antimicotica nella piastra di coltura tissutale pulita e inclinarla in modo che il liquido si accumuli su un lato della piastra.
    6. Tritare il derma in2 pezzi da 1-2 mm e trasferirli in una nuova provetta conica da 50 mL.
      NOTA: Questo passaggio deve idealmente essere completato entro 4-5 minuti, poiché non si prevede che un'elaborazione più lunga fornisca una resa o una sopravvivenza cellulare più elevate.
    7. Aggiungere 10 mL della soluzione di Collagenasi di Tipo II.
    8. Aggiungere 50 μL (25 unità/mL di soluzione) di soluzione di DNAsi I (riduce l'aggregazione cellulare) e digerire la soluzione dermica per 2 ore a 37 °C con agitazione continua (utilizzare un'incubatrice rotante/agitatrice a 30-50 giri/min).
      NOTA: Controllare periodicamente per identificare se la maggior parte del derma è stata digerita. In caso contrario, aumentare il tempo di digestione (1 ora in più al massimo) e la velocità di agitazione, se possibile.
    9. Rivestire piastre di coltura tissutale da 60 mm con 2 mL di collagene di tipo I da 10 μg/mL in acido acetico 0,02 M per >20 minuti a 37 °C. Lavare 2 volte con PBS sterile.
    10. Filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro cellulare da 70 μm e centrifugare a 250 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante.
    11. Risospendere in 10 ml di DMEM con 1x soluzione antibiotico-antimicotica.
    12. Filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro cellulare da 40 μm e centrifugare a 250 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante.
    13. Risospendere in 1 mL di terreno LEC completo (Endothelial Cell Growth Base Medium with Supplement).
    14. Piastra le cellule nella piastra di coltura tissutale da 60 mm rivestita di collagene in terreno LEC completo. Questo sarà il giorno 0 della coltura cellulare.
    15. Sostituire il supporto ogni 2 giorni lavando le celle con 1x PBS due volte e aggiungendo nuovi terreni LEC.
    16. Ripetere il passaggio 2.1.15 fino a quando le celle sono confluenti all'80-90%.
      NOTA: Se la purificazione viene eseguita prima che le cellule siano confluenti all'80-90%, verranno isolate meno cellule endoteliali linfatiche. Questo processo richiede dai 7 ai 10 giorni circa.

3. Rivestimento magnetico delle perle con anticorpo LYVE-1

NOTA: Un giorno prima della fase di purificazione, preparare i seguenti materiali e attrezzature: frigorifero a 4 °C, rotore, separatore magnetico, PBS, biglie magnetiche IgG anti-coniglio, provette per microcentrifuga, filtri per siringhe da 0,2 μm, soluzione di rivestimento per perline magnetiche, anticorpo LYVE-1.

  1. Preparare la soluzione di rivestimento con microsfere magnetiche: 20 ml di PBS con 0,1% BSA e 2 mM EDTA e sterilizzarla con filtro. Conservarlo a 4 °C.
    NOTA: Si sconsiglia di conservare più di qualche giorno; Verificare la presenza di precipitati o contaminazioni prima dell'uso.
  2. Pipettare 500 μL di microsfere magnetiche IgG anti-coniglio in una provetta da microcentrifuga e aggiungere 1 mL di soluzione di rivestimento di microsfere magnetiche ghiacciata.
  3. Utilizzare un separatore magnetico per lavare le perline.
  4. Ripetere i lavaggi 2 volte con 1 mL della soluzione di rivestimento per perline magnetiche ghiacciata.
  5. Risospendere le perle in 500 μL di soluzione di rivestimento di perline magnetiche e fare aliquote da 150 μL in provette per microcentrifuga.
  6. Aggiungere 15 μg di anticorpo LYVE-1 in ciascuna provetta (15 μL da 1 mg/mL di concentrazione di anticorpi scordati).
  7. Incubare per una notte a 4 °C con agitazione continua.

4. Purificazione delle cellule endoteliali linfatiche

NOTA: Preparare i seguenti materiali e attrezzature: incubatore di CO2 , agitatore, timer, parafilm, DMEM, 1 soluzione antibiotico-antimicotica, BSA, PBS, soluzione di rivestimento con perline magnetiche, tripsina-EDTA, piastre per colture tissutali da 100 mm o 60 mm, filtri per siringhe da 0,2 μm, collagene di tipo I, acido acetico, terreno LEC.

  1. Preparare 50 ml di DMEM con 1x soluzione antibiotico-antimicotica e 0,1% di BSA e sterilizzarlo con filtro.
  2. Rivestire piastre di coltura tissutale da 60 mm con 10 μg/mL di collagene di tipo I in acido acetico 0,02 M per >20 minuti a 37 °C. Lavare 2 volte con PBS sterile.
  3. Lavare le perle prerivestite con 1 ml di soluzione di rivestimento per perline magnetiche, utilizzando un separatore magnetico.
  4. Risospendere le perle in 150 μL di DMEM con lo 0,1% di BSA.
    NOTA: Le perle possono ora essere conservate a 4 °C per un massimo di 1 mese.
  5. Lavare le celle 2 volte con PBS.
  6. Aggiungere alle cellule 3 mL di DMEM con BSA allo 0,1% (per una piastra di coltura tissutale da 60 mm) e 50 μL di perle coniugate con anticorpi.
    NOTA: Se le cellule di due o più topi sono raggruppate, utilizzare una piastra di coltura tissutale da 100 mm e aggiungere 6 ml di DMEM con BSA allo 0,1%.
  7. Sigillare il piatto con parafilm.
  8. Posizionare la capsula su uno shaker agitando a 10 RPM a RT e incubare per esattamente 10 minuti.
    NOTA: Un'incubazione più lunga comporterà un legame non specifico. Per garantire che le perle interagiscano con l'intera superficie della piastra, ruotare manualmente la piastra ogni pochi minuti mentre continua a tremare.
  9. Scartare il terreno e lavare le celle una volta con PBS. Ispezionare rapidamente le cellule per verificare la presenza di colonie di LEC sulla piastra.
  10. Tripsinizzare le cellule: utilizzare 1 mL di tripsina-EDTA e incubare per 3 minuti a 37 °C. Ispezionare le celle per verificare che il distacco delle cellule sia riuscito.
  11. Neutralizzare la soluzione con 2 mL di terreno LEC completo e trasferire la soluzione in una provetta sterile in polipropilene da 5 mL.
  12. Utilizzando un separatore magnetico, le celle vengono lavate con 4 x 3 mL di DMEM con lo 0,1% di BSA per rimuovere le cellule non legate.
  13. Risospendere le restanti cellule legate alle perle in un terreno LEC completo e su piastre per colture tissutali da 60 mm precedentemente rivestite di collagene.
  14. Incubare le cellule a 37 °C e cambiare il terreno a giorni alterni dopo due lavaggi PBS ogni volta.
  15. Coltivare le cellule fino a quando non raggiungono la confluenza (normalmente ci vogliono dai 7 ai 10 giorni).
  16. A quel punto, controllare le cellule al microscopio per la confluenza e procedere con la preparazione delle cellule per la citometria a flusso. Se viene identificata un'alta percentuale di F4/80+, ripetere nuovamente la fase di purificazione con LYVE-1 (Fase 4: Purificazione delle cellule endoteliali linfatiche) o idealmente un altro marcatore linfatico (ad es. podoplanina14).
    NOTA: L'elevata espressione della proteina bersaglio dell'anticorpo sulla popolazione cellulare purificata con biglie magnetiche è stata dimostrata15,16. Tuttavia, per LYVE-1, è importante eseguire un controllo di citometria a flusso per l'identificazione della percentuale di altre cellule LYVE-1+, per lo più macrofagi. LYVE-1 è espresso solo in sottogruppi di macrofagi associati a tumori e ferite, mentre nella pelle sana, l'espressione di LYVE-1 è più limitata alle cellule endoteliali linfatiche17. Pertanto, lo screening F4/80 non è obbligatorio, ma piuttosto dipende dal contesto sperimentale. I topi utilizzati per la dimostrazione non portavano tumori o ferite, ma solo una potenziale infiammazione da depilazione, ma abbiamo incluso la colorazione F4/80 come base della percentuale di macrofagi LYVE-1+.

5. Citometria a flusso

NOTA: Preparare i seguenti materiali e attrezzature: centrifuga, incubatore di CO2 , timer, emocitometro, soluzione EDTA, 1x soluzione antibiotico-antimicotica, BSA, PBS, tripsina-EDTA, provette in polipropilene, filtri per siringhe da 0,2 μm, etanolo al 70%, anticorpo coniugato F4/80 FITC.

  1. Preparare il PBS contenente lo 0,1% di BSA e sterilizzarlo con filtro.
  2. Preparare 1 mM di soluzione EDTA in PBS.
  3. Tripsinizzare le cellule: incubare le cellule con 1 mL di soluzione di EDTA 1 mM per 5 minuti a 37 °C.
    NOTA: L'incubazione con soluzione di EDTA è un metodo più delicato di distacco cellulare, che preserva meglio le proteine transmembrana ed è preferibile, ma richiede periodi di incubazione più lunghi. In alternativa, la soluzione di tripsina-EDTA può essere utilizzata per un'incubazione di 1 minuto a 37 °C, ma ciò può influire sull'affinità anticorpale per le applicazioni di citometria a flusso.
  4. Neutralizzare la soluzione con 2 mL di terreno LEC completo e trasferire la soluzione in una provetta sterile in polipropilene da 5 mL.
  5. Centrifugare i campioni a 250 × g per 5 minuti.
  6. Lavare con PBS.
  7. Ripetere la centrifugazione e il lavaggio PBS.
  8. Risospendere le cellule in PBS contenente lo 0,1% di BSA e contarle utilizzando un emocitometro o un metodo alternativo. Aliquotare ~1 × 106 celle in provette di polipropilene con un volume finale di 100 μl. Da questo passaggio in poi, eseguire tutti i passaggi a 4 °C.
    NOTA: Le celle possono essere fissate prima della colorazione o colorate mentre sono vive. La fissazione può essere subottimale per la citometria a flusso, poiché alcuni anticorpi potrebbero non rilevare gli antigeni dopo la fissazione; Pertanto, si consiglia di eseguire la citometria a flusso subito dopo il passaggio precedente e di saltare il passaggio di fissazione. Se ciò non è possibile, la fissazione prima dell'esperimento di citometria a flusso consentirà un ritardo nella fase di citometria a flusso. Se si deve eseguire la fissazione, le prestazioni degli anticorpi nel contesto delle cellule fissate devono essere valutate in anticipo.
  9. Eseguire la fissazione (passaggio facoltativo; se le cellule non devono essere fissate, procedere con l'immunocolorazione): risospendere le cellule in etanolo ghiacciato al 70% e mescolare delicatamente per 10 minuti con ghiaccio.
    NOTA: La fissazione dell'etanolo può permeabilizzare le cellule e portare al rilascio di GFP; Tuttavia, la fissazione a base di paraformaldeide può distruggere i coloranti utilizzati per la citometria a flusso e, idealmente, può essere evitata.
  10. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
  11. Lavare le celle 2 volte per centrifugazione a 250 × g per 5 minuti in 1x PBS.
  12. Procedere al passaggio successivo o risospendere le cellule in 0,5-1 mL di 1x PBS e conservarle a 4 °C.

6. Immunocolorazione

NOTA: Maneggiare le cellule con delicatezza ed evitare il pipettaggio esteso, quando possibile, per mantenere l'integrità della membrana cellulare e ridurre al minimo la morte cellulare, assicurandosi che le cellule non formino grumi. Dalle cellule endoteliali isolate, preparare i seguenti gruppi: cellule non colorate e cellule colorate con un altro marcatore di cellule endoteliali (ad es. VEGFR3, podoplanina), F4/80 ed entrambi. Includere le cellule endoteliali e i macrofagi linfatici di topo disponibili in commercio, se disponibili, come controlli positivi. A scopo dimostrativo, e a causa della fluorescenza endogena tdTomato (PE+), abbiamo utilizzato la colorazione F4/80 coniugata FITC.

  1. Diluire l'anticorpo primario in PBS con BSA allo 0,1% secondo la diluizione raccomandata o ottimizzata. Aggiungere 0,5 μg (1 μL di soluzione anticorpale) dell'anticorpo coniugato F4/80 FITC ai 100 μL della sospensione cellulare.
  2. Risospendere le cellule dopo l'aggiunta dell'anticorpo fluorescente coniugato diluito. Mescolare muovendo il tubo di polipropilene per assicurarsi che non ci siano grumi e che tutte le celle siano adeguatamente rivestite.
  3. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente (celle fisse) o 30 minuti su ghiaccio (cellule vive) al buio.
  4. Lavare le celle 2 volte centrifugandole a 250 × g per 5 minuti a 4 °C (per cellule vive) o a temperatura ambiente (per celle fisse), utilizzando PBS con 0,1% BSA al buio.
  5. Per anticorpi non coniugati in fluorescenza
    1. Diluire l'anticorpo secondario coniugato con fluorocromo nel tampone di incubazione. Per gli anticorpi Alexa Flour, utilizzare una diluizione 1:500.
    2. Aggiungere l'anticorpo secondario a 100 μl della soluzione di sospensione cellulare.
    3. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (cellule fisse) o su ghiaccio (cellule vive).
    4. Lavare due volte per centrifugazione a 250 × g per 5 minuti a 4 °C (per cellule vive) o a temperatura ambiente (per cellule fisse) nel tampone di incubazione.
  6. Risospendere le cellule in 0,5 mL di 1x PBS e analizzarle utilizzando un citometro a flusso.
  7. Segui questi passaggi della strategia di gating per identificare la popolazione di macrofagi all'interno delle cellule che esprimono LYVE-1:
    1. Considerare lo scattering diretto e laterale per distinguere la popolazione cellulare.
    2. Considerare la dispersione in avanti per le dimensioni, l'area e l'altezza delle celle per distinguere le singole celle (singoletto).
    3. Prendere in considerazione l'espressione di F4/80 (FITC) e l'espressione di RFP (PE) per identificare i macrofagi (F4/80+) all'interno delle cellule murine isolate che esprimono tdTomato (PE) (a causa della presenza di un reporter fluorescente tdTomato nei topi specifici, descritto di seguito).

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Risultati

Il metodo è stato sviluppato per identificare l'espressione proteica di una piccola GTPasi, RhoA, il cui gene codificante è stato floxato in entrambi gli alleli e deleto sotto l'effetto del promotore endoteliale specifico dell'endotelio linfatico inducibile dal tamoxifene Prox1-CreERT2 18. Le LEC isolate possono essere coltivate per un massimo di quattro generazioni, dopodiché diventano senescenti. Sono stati congelati, scongelati e stimolati con successo con angiopoietina-2...

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Discussione

Il sistema linfatico è un importante regolatore della funzione omeostatica del corpo, con le funzioni più importanti che sono il mantenimento del plasma fluido, la rimozione dei sottoprodotti del metabolismo cellulare e delle molecole tossiche, l'assorbimento dei lipidi e il traffico delle cellule immunitarie 1,19. L'identificazione di marcatori appropriati ha provocato un'esplosione di nuovi dati nel campo linfatico, rivelando nuove funzioni del sistema vascol...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione ellenica per la ricerca e l'innovazione (00376), dal National Institutes of Health, dal National Cancer Institute (NCI) [Grant R15CA231339], dalla Texas Tech University Health Sciences Center (TTUHSC) School of Pharmacy Office of the Sciences grant (a CMM) e dal College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe start-up funding, il National Institutes of Health (NIH) attraverso il National Institute of General Medical Science [Grant P20 GM103424-21] e il Research Competitiveness Subprogram (RCS) del Louisiana Board of Regents attraverso il Board of Regents Support Fund (LEQSF(2021-24)-RD-A-23) (a G.M.). Le comuni apparecchiature TTUHSC utilizzate sono state ottenute attraverso le sovvenzioni del Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) RP190524 e RP200572. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, nella decisione di scrivere o nella preparazione del manoscritto. L'abstract grafico nella Figura 1A è stato creato con BioRender.com.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm Syringe FiltersFisher Scientific09-719C
100 mm Tissue Culture DishesFisher ScientificFB012924
60 mm Tissue Culture DishesFisher ScientificFB012921
Animal Hair ClipperWahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100xFisher Scientific15240-062
Blunt ForcepsFine Science Tools11992-20
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA4919
Cell Strainer 40 μmFisher Scientific542040
Cell Strainer 70 μmFisher Scientific542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat TailCorning354249dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O
Collagenase Type IILife Technologies17101-015
DispaseLife Technologies17105-041
DMEMFisher Scientific11-995-073
DNAse I Solution (2,500 U/mL)Thermo Scientific90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle ConcentratorInvitrogen120-21D
EDTASigma-Aldrich3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium)R&D SystemsCCM027
Euthanasia chamberEuthanex Corporation
Fine ForcepsFine Science Tools11255-20
Fine Scissors-SharpFine Science Tools14060-10
FITC anti-mouse F4/80 AntibodyBiolegend123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic BeadsNew England BiolabsS1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction ChamberEuthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG BeadsThermo Scientific21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBSFisher ScientificAAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1ReliaTech GmbH103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene TubesCorning352063
Syringe Filters w 0.2 μm PoresFisher Scientific09-719C
Trypsin-EDTAFisher Scientific25-300-120

Riferimenti

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