小鼠真皮淋巴内皮细胞分离

摘要

本文介绍了一种基于磁珠从真皮淋巴毛细血管中分离小鼠内皮细胞的方法。分离的淋巴内皮细胞可用于下游 体外 实验和蛋白质表达分析。

摘要

淋巴系统参与免疫监视、脂质吸收和组织液平衡的调节。小鼠淋巴内皮细胞的分离是淋巴研究的一个重要过程，因为它允许对分离的细胞进行 体外 和生化实验。此外，Cre-lox技术的发展使无法全局靶向的组织特异性基因缺陷成为可能，从而可以精确确定它们在所研究组织中的作用。解剖某些基因在淋巴生理学和病理生理学中的作用需要使用淋巴特异性启动子，因此需要对靶基因的表达水平进行实验验证。

从野生型或转基因小鼠中有效分离淋巴内皮细胞的方法使得可以使用 离体 和 体外 测定来研究调节淋巴功能的机制和鉴定所研究蛋白质的表达水平。我们已经开发、标准化并提出了一种通过基于 LYVE-1 表达的磁珠纯化有效分离小鼠真皮淋巴内皮细胞 （DLECs） 的方案。概述的协议旨在为研究人员提供一种工具，以进一步理解和阐明淋巴内皮细胞功能的重要参与者，特别是在没有荧光激活细胞分选设备的设施中。

引言

淋巴系统在人体生理学中起着举足轻重的作用。它被认为是一种重要的稳态因子，可促进重要功能，例如维持组织-浆液平衡、免疫监视和脂质吸收¹，以及最近发现的功能，例如心脏的修复能力² 和骨骼和造血的再生能力³。尽管淋巴系统具有重要作用，但淋巴管作用的几个方面，以及控制某些生理参数和反应的分子机制仍然难以捉摸。此外，淋巴管缺损是某些病理生理状况的触发或恶化因素。众所周知的例子是原发性和继发性淋巴水肿，分别取决于疾病的遗传或非遗传起源，而淋巴系统对原发性肿瘤生长和转移性播散的作用至关重要，因为它可以作为转移的管道和免疫功能的调节剂¹。

与血管系统相比，淋巴管的研究和知识滞后主要是由于淋巴系统与血管系统相比发现较晚，以及淋巴管特异性分子标志物的鉴定延迟。近几十年来，这种情况有了很大的改善，导致淋巴管在稳态和疾病条件下的传统情况发生了变化¹。与血管生成类似，淋巴管生成是从预先存在的淋巴管形成新的淋巴管，在多种疾病的发展中起着关键作用^4,5,6。然而，与血管生成不同，淋巴管生成的研究主要局限于体内模型，重点关注病理模型中的发育血管形成和结构缺陷。淋巴内皮细胞的分离对于体外研究很重要，这可以通过所提出的方案提供。

已经开发了几种用于从小鼠中分离淋巴内皮的方案，这些方案需要使用荧光激活的细胞分^选7。细胞分选仪的优点是纯度更高，与基于微球的分离相反，后者的产量更高。该方案利用淋巴内皮透明质酸受体 1 （LYVE-1） 的表达，这是一种淋巴内皮标志物，对淋巴管内的细胞运输很重要 ^4,8。由于 LYVE-1 表达仅限于淋巴毛细血管而不是集合淋巴管，因此该技术适用于从淋巴毛细血管中特异性分离淋巴内皮细胞，这与其他淋巴标志物相反，例如在所有淋巴内皮细胞中均匀表达的 podoplanin9。对于该方案，排除了其他非跨膜的重要淋巴标志物，例如 Prox1。

由于生理结果是淋巴管生成，通常在淋巴毛细血管处启动，因此选择 LYVE-1 作为靶标，因为它在这些细胞中的选择性以及所选抗体的产量高。使用的酶是 II 型胶原酶，通常已知其在胶原解离方面比 I 型更有效¹⁰，以及分散酶（一种更广泛的蛋白酶，通常用于真皮-表皮分离¹¹;然而，已经报道了其他用于组织分离的酶^12,13 并且可以使用。该协议的目标是描述一种使用磁珠纯化从成年小鼠的淋巴毛细血管中高产量分离真皮淋巴内皮细胞的方法，特别是在荧光激活细胞分选不容易获得的地方。该方法适用于淋巴内皮细胞纯度可能会因下游应用而受到影响的应用。

研究方案

动物研究是根据德克萨斯理工大学健康科学中心 （TTUHSC） 的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准的协议进行的，用于 TTUHSC 的实验，以及根据指令 2010/63 在希腊西部地区兽医管理局进行的实验在帕特雷大学的实验。在处理动物粪便时，认真遵守废物处理规定。

1.小鼠真皮的分离

1. 第1天
   注意：在第 1 天;准备好以下材料和设备：麻醉室、动物毛发夹、异氟醚、细镊子、0.2 μm 注射器过滤器。
   1. 在含有 1x 抗生素 - 抗真菌溶液的 DMEM 中制备 2 mg/mL 分散酶溶液，并对其进行过滤灭菌。
      注：培养基或PBS的使用可以用HBSS代替，因为它已在其他报道的方案中成功使用¹²。1x抗生素 - 抗真菌溶液可以通过添加青霉素（100IU / mL），链霉素（100μg/ mL）和两性霉素（2.5μg/ mL）来替代。
   2. 通过将小鼠置于具有异氟烷给药（0.5-2%异氟烷，流量：1L / min）的麻醉室中来麻醉小鼠。小鼠停止移动后，将其从笼子中移出，并继续麻醉调整具有相似异氟烷流量的鼻锥。用脚趾捏住动物以确认足够的麻醉水平，并不断监测小鼠以确保保持深度麻醉（没有运动）。使用理发器沿中线纵向夹约 9 cm² 的背毛和腹毛（分别为小鼠背部和腹部）。让小鼠从麻醉中恢复过来，然后将其放回笼子里。
      注意：可以改用脱毛（脱毛）霜。确保在要隔离的皮肤区域完全去除毛发，同时保持皮肤的完整性。尝试夹尽可能延长的皮肤区域。为确保脱毛的潜在炎症得到解决，必须在第二天进行细胞分离。为了增加分离细胞的数量，每组聚集2至4只小鼠。
2. 第2天
   注意：准备好以下材料和设备：安乐死室、生物安全柜、CO₂ 培养箱、乙醇、细剪刀、细镊子、钝镊子、100 毫米组织培养板、分散酶、DMEM、1x 抗生素 - 抗真菌溶液。
   1. 通过CO₂ 给药对小鼠实施安乐死，并将其置于仰卧位置，露出夹紧的区域。喷洒 70% 乙醇作为消毒剂。
      注意：从此步骤开始，所有步骤都必须在无菌条件下（在生物安全柜中）执行。
   2. 将无菌 100 mm 组织培养板放在冰上。
   3. 在腹部做一个 0.5 英寸的浅切口，并沿中线纵向切至颈部和下腹部。进行横向切割，以便能够剥开皮肤。
      注意：切口大小和分离的皮肤区域取决于小鼠的大小。
   4. 使用钝镊子，小心地将皮肤与周围组织分开。这样做绕过小鼠的整个躯干，在颈部和下腹部横向切开皮肤。
   5. 小心地将皮肤放入 100 毫米组织培养板中，真皮面朝下，尽可能保持皮肤拉伸。盖上盘子，把它们放在冰上。完成组中所有小鼠的分离。
   6. 从所有小鼠中提取皮肤后，在室温下孵育板10分钟以使外植体变平。
   7. 向板中加入6mL Dispase溶液，确保皮肤完全浸入水中，并在4°C下轻度搅拌孵育过夜。
      注意：也可以进行胰蛋白酶消化而不是分散酶¹²，然后进行 Liberase 而不是 II 型胶原酶处理（下图）。

2. 从真皮中分离细胞

1. 第3天
   注意：准备好以下材料和设备：离心机、CO₂ 培养箱、生物安全柜、剪刀、DMEM、1x 抗生素-抗真菌溶液、II 型胶原酶、PBS、50 mL 锥形管、100 mm 和 60 mm 组织培养板、DNAse I 溶液、I 型胶原、70 μm 和 40 μm 细胞过滤器、0.2 μm 注射器过滤器、LEC 培养基。
   1. 制备 500 mL 1x PBS（1.37 M NaCl、27 mM KCl、100 mM Na₂HPO₄、18 mM KH₂PO 4，pH 7.4）并在 15 psi 下高压灭菌 20 分钟或过滤器灭菌。或者，使用市售的无菌 PBS。
   2. 在含有 1x 抗生素 - 抗真菌溶液的 DMEM 中制备 10 mL 2 mg/mL II 型胶原酶溶液，并对其进行过滤灭菌。
      注意：在无菌罩下执行后续步骤，以减少样品污染的机会。
   3. 使用移液管从培养皿中取出液体。
   4. 使用镊子将真皮（皮肤底部）与表皮（顶部）分开，并去除任何明显的脂肪组织。将真皮转移到干净的组织培养板上。
   5. 在干净的组织培养板中加入 1 mL DMEM 和 1x 抗生素 - 抗真菌溶液，并倾斜它，使液体积聚在板的一侧。
   6. 将真皮切成 1-2 mm² 块，然后将它们转移到新的 50 mL 锥形管中。
      注意：理想情况下，此步骤必须在 4-5 分钟内完成，因为预计更长的处理时间不会提供更高的产量或细胞存活率。
   7. 加入 10 mL II 型胶原酶溶液。
   8. 加入50μL（25单位/ mL溶液）DNAse I溶液（减少细胞聚集），并在37°C下连续搅拌消化真皮溶液2小时（使用旋转/振荡培养箱，转速为30-50rpm）。
      注意：定期检查以确定大部分真皮是否已被消化。如果没有，如果可能，增加消化时间（最多额外 1 小时）和搅拌速度。
   9. 在37°C下用2mL 10μg/ mLI型胶原蛋白在0.02M乙酸中包被60mm组织培养板>20分钟。 用无菌 PBS 洗涤 2 次。
   10. 使用 70 μm 细胞过滤器过滤细胞悬浮液，并以 250 × g 离心 5 分钟。丢弃上清液。
   11. 用 1x 抗生素 - 抗真菌溶液重悬于 10 mL DMEM 中。
   12. 使用 40 μm 细胞过滤器过滤细胞悬浮液，并以 250 × g 离心 5 分钟。丢弃上清液。
   13. 重悬于 1 mL 完全 LEC 培养基（含添加剂的内皮细胞生长基础培养基）中。
   14. 将细胞铺板在胶原包被的 60 mm 组织培养板中，置于完全 LEC 培养基中。这将是细胞培养的第 0 天。
   15. 每 2 天更换培养基，用 1x PBS 洗涤细胞两次并加入新鲜的 LEC 培养基。
   16. 重复步骤 2.1.15，直到细胞汇合 80-90%。
       注意：如果在细胞汇合 80-90% 之前进行纯化，则分离出的淋巴内皮细胞会更少。此过程大约需要 7 到 10 天。

3. 带有 LYVE-1 抗体的磁珠涂层

注意：在纯化步骤前一天，请准备好以下材料和设备：4°C冰箱，转子，磁选仪，PBS，抗兔IgG磁珠，微量离心管，0.2μm注射器过滤器，磁珠涂层溶液，LYVE-1抗体。

1. 制备磁珠包衣溶液：20 mL PBS 与 0.1% BSA 和 2 mM EDTA 并过滤灭菌。将其储存在4°C。
   注意：不建议存放超过几天;使用前检查是否有沉淀物或污染。
2. 将 500 μL 抗兔 IgG 磁珠移液至微量离心管中，并加入 1 mL 冰冷的磁珠包被溶液。
3. 使用磁性分离器清洗珠子。
4. 用 1 mL 冰冷的磁珠涂层溶液重复洗涤 2 次。
5. 将珠子重悬于 500 μL 磁珠包被溶液中，并在微量离心管中制备 150 μL 的等分试样。
6. 向每个试管中加入 15 μg LYVE-1 抗体（从 1 mg/mL 抗体储备液浓度中加入 15 μL）。
7. 在4°C下孵育过夜，持续搅拌。

4.淋巴管内皮细胞纯化

注意：准备好以下材料和设备：CO₂ 培养箱、摇床、计时器、封口膜、DMEM、1x 抗生素 - 抗真菌溶液、BSA、PBS、磁珠包被溶液、胰蛋白酶-EDTA、100 mm 或 60 mm 组织培养板、0.2 μm 注射器过滤器、I 型胶原蛋白、乙酸、LEC 培养基。

1. 用 1x 抗生素 - 抗真菌溶液和 0.1% BSA 制备 50 mL DMEM，并对其进行过滤灭菌。
2. 在37°C下用10μg/ mL I型胶原蛋白在0.02M乙酸中包被60mm组织培养板>20分钟。 用无菌 PBS 洗涤 2 次。
3. 使用磁性分离器用 1 mL 磁珠包被溶液洗涤预包被的珠子。
4. 将珠子重悬于含有 0.1% BSA 的 150 μL DMEM 中。
   注意：珠子现在可以在4°C下储存长达1个月。
5. 用 PBS 洗涤细胞 2 次。
6. 向细胞中加入 3 mL 含 0.1% BSA（用于 60 mm 组织培养板）的 DMEM 和 50 μL 抗体偶联珠。
   注意：如果来自两只或更多小鼠的细胞合并，请使用 100 mm 组织培养板并加入 6 mL 含有 0.1% BSA 的 DMEM。
7. 用石蜡膜密封培养皿。
8. 将培养皿放在振荡器上，在室温下以 10 RPM 搅拌，孵育正好 10 分钟。
   注意：较长的孵育时间将导致非特异性结合。为确保珠子与整个板表面相互作用，请在板继续摇晃时每隔几分钟手动旋转板。
9. 丢弃培养基并用 PBS 洗涤细胞一次。快速检查细胞以验证板上是否存在 LEC 集落。
10. 胰蛋白酶消化细胞：使用1mL胰蛋白酶-EDTA，并在37°C下孵育3分钟。 检查细胞是否成功脱离细胞。
11. 用 2 mL 完全 LEC 培养基中和溶液，并将溶液转移到 5 mL 无菌聚丙烯管中。
12. 使用磁性分离器洗涤含有 0.1% BSA 的 4 x 3 mL DMEM 细胞以去除未结合的细胞。
13. 将剩余的珠子结合细胞重悬于完全 LEC 培养基中，并铺在先前胶原包被的 60 mm 组织培养板上。
14. 将细胞在37°C下孵育，并在每次两次PBS洗涤后每隔一天更换培养基。
15. 培养细胞直至它们达到汇合（通常需要 7 到 10 天）。
16. 此时，在显微镜下检查细胞的汇合度，并继续准备用于流式细胞术的细胞。如果确定 F4/80+ 百分比较高，则再次使用 LYVE-1（第 4 步：淋巴内皮细胞纯化）重复纯化步骤，理想情况下使用另一种淋巴标志物（即 podoplanin¹⁴）。
    注：抗体靶向的蛋白质在磁珠纯化细胞群上的高表达已被证明^15,16。然而，对于 LYVE-1，进行流式细胞术控制以识别其他 LYVE-1+ 细胞（主要是巨噬细胞）的百分比非常重要。LYVE-1 仅在与肿瘤和伤口相关的巨噬细胞亚群中表达，而在健康皮肤中，LYVE-1 的表达更局限于淋巴内皮细胞¹⁷。因此，F4/80 筛选不是强制性的，而是取决于实验环境。用于演示的小鼠不携带肿瘤或伤口，只是脱毛引起的潜在炎症，但我们将 F4/80 染色作为 LYVE-1+ 巨噬细胞百分比的基线。

5. 流式细胞术

注意：准备好以下材料和设备：离心机、CO₂ 培养箱、计时器、血细胞计数器、EDTA 溶液、1x 抗生素 - 抗真菌溶液、BSA、PBS、胰蛋白酶-EDTA、聚丙烯管、0.2 μm 注射器过滤器、70% 乙醇、F4/80 FITC 偶联抗体。

1. 制备含有 0.1% BSA 的 PBS 并对其进行过滤灭菌。
2. 在PBS中制备1mM EDTA溶液。
3. 胰蛋白酶消化细胞：将细胞与1mL 1mM EDTA溶液在37°C下孵育5分钟。
   注意：用EDTA溶液孵育是一种较温和的细胞分离方法，可以更好地保留跨膜蛋白，是首选，但需要更长的孵育期。或者，胰蛋白酶-EDTA溶液可以在37°C下孵育1分钟，但这会影响流式细胞术应用的抗体亲和力。
4. 用 2 mL 完全 LEC 培养基中和溶液，并将溶液转移到 5 mL 无菌聚丙烯管中。
5. 将样品以 250 × g 离心 5 分钟。
6. 用PBS清洗。
7. 重复离心和PBS洗涤。
8. 将细胞重悬于含有0.1%BSA的PBS中，并使用血细胞计数器或其他方法对其进行计数。将 ~1 × 10⁶ 个细胞分装到聚丙烯管中，最终体积为 100 μl。从此步骤开始，在4°C下执行所有步骤。
   注意：细胞可以在染色前固定，也可以在活细胞染色时进行染色。对于流式细胞术来说，固定可能不是最优的，因为一些抗体在固定后可能无法检测到抗原;因此，我们建议在上一步后立即运行流式细胞术，并跳过固定步骤。如果无法做到这一点，在流式细胞术实验之前进行固定将允许流式细胞术步骤的延迟。如果要进行固定，应事先评估抗体在固定细胞环境中的性能。
9. 进行固定（可选步骤;如果细胞不被固定，则进行免疫染色）：将细胞重悬于冰冷的70%乙醇中，并在冰上轻轻混合10分钟。
   注意：乙醇固定可以透化细胞并导致GFP的释放;然而，基于多聚甲醛的固定会破坏用于流式细胞术的染料，理想情况下可以避免。
10. 在室温下孵育15分钟。
11. 在 1x PBS 中以 250 × g 离心 2 次洗涤细胞 5 分钟。
12. 继续下一步或将细胞重悬于0.5-1mL 1x PBS中，并储存在4°C。

6. 免疫染色

注意：如果可能，轻柔地处理细胞并避免大量移液，以保持细胞膜的完整性并最大限度地减少细胞死亡，确保细胞不会形成团块。从分离的内皮细胞中，制备以下组：未染色细胞和具有另一种内皮细胞标志物（即 VEGFR3、podoplanin）、F4/80 和/或两者的染色细胞。包括市售的小鼠淋巴内皮细胞和巨噬细胞（如果有）作为阳性对照。出于演示目的，并且由于内源性 tdTomato 荧光 （PE+），我们使用了 FITC 偶联的 F4/80 染色。

1. 根据推荐或优化的稀释度，用 0.1% BSA 稀释 PBS 中的一抗。将 0.5 μg（1 μL 抗体溶液）F4/80 FITC 偶联抗体加入 100 μL 细胞悬液中。
2. 加入稀释的荧光偶联抗体后重悬细胞。通过轻弹聚丙烯管进行混合，以确保没有结块并且所有细胞都正确包被。
3. 在室温（固定细胞）下孵育1小时或在黑暗中在冰（活细胞）上孵育30分钟。
4. 通过在4°C（对于活细胞）或室温（对于固定细胞）下以250× g 离心细胞5分钟，在黑暗中使用含有0.1%BSA的PBS洗涤细胞2次。
5. 对于非荧光偶联抗体
   1. 在孵育缓冲液中稀释荧光染料偶联的二抗。对于 Alexa Flour 抗体，使用 1：500 稀释度。
   2. 将二抗加入 100 μL 细胞悬浮液中。
   3. 在室温（固定细胞）或冰（活细胞）下孵育30分钟。
   4. 通过在4°C（对于活细胞）或室温（对于固定细胞）下在孵育缓冲液中以250× g 离心5分钟洗涤两次。
6. 将细胞重悬于 0.5 mL 1x PBS 中，并使用流式细胞仪进行分析。
7. 按照以下门控策略步骤来鉴定表达 LYVE-1 的细胞内的巨噬细胞群：
   1. 考虑前向散射和侧向散射以区分细胞群。
   2. 考虑对细胞大小、面积和高度进行前向散射，以区分单细胞（单峰）。
   3. 考虑F4 / 80（FITC）表达和RFP（PE）表达以识别表达tdTomato（PE）的分离小鼠细胞中的巨噬细胞（F4 / 80 +）（由于在特定小鼠中存在荧光tdTomato报告基因，如下所述）。

结果

该方法用于鉴定小 GTP 酶 RhoA 的蛋白表达，该酶的编码基因在他莫昔芬诱导的淋巴内皮特异性启动子 Prox1-CreER^{T2 18} 的作用下在两个等位基因中发生絮状并缺失。分离的 LEC 可以培养多达四代，之后它们会衰老。它们已被冷冻、解冻，并成功用血管生成素-2 刺激。由于细胞传代次数有限，我们尚未尝试多次冻融循环。从一只小鼠分离出的典型细胞产量提供了 60 mm 培养...

讨论

淋巴系统是机体稳态功能的重要调节器，最重要的功能是维持液体血浆、去除细胞代谢副产物和有毒分子、脂质吸收和免疫细胞运输 ^1,19。适当标记物的识别在淋巴管领域引发了新数据的激增，揭示了淋巴管系统的新功能，例如它们在某些器官的修复和再生能力中的作用 ^2,3。关于淋巴系统的知识越来越多，描...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Syringe Filters	Fisher Scientific	09-719C
100 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012924
60 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012921
Animal Hair Clipper	Wahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100x	Fisher Scientific	15240-062
Blunt Forceps	Fine Science Tools	11992-20
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4919
Cell Strainer 40 μm	Fisher Scientific	542040
Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat Tail	Corning	354249	dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O
Collagenase Type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM	Fisher Scientific	11-995-073
DNAse I Solution (2,500 U/mL)	Thermo Scientific	90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator	Invitrogen	120-21D
EDTA	Sigma-Aldrich	3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium)	R&D Systems	CCM027
Euthanasia chamber	Euthanex Corporation
Fine Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Fine Scissors-Sharp	Fine Science Tools	14060-10
FITC anti-mouse F4/80 Antibody	Biolegend	123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads	New England Biolabs	S1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber	Euthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads	Thermo Scientific	21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS	Fisher Scientific	AAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	SH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1	ReliaTech GmbH	103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene Tubes	Corning	352063
Syringe Filters w 0.2 μm Pores	Fisher Scientific	09-719C
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25-300-120