Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

요약

이 논문은 진피 림프 모세혈관에서 쥐 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 분리된 림프 내피 세포는 다운스트림 in vitro 실험 및 단백질 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

초록

림프계는 면역 감시, 지질 흡수 및 조직액 균형의 조절에 참여합니다. 쥐 림프 내피 세포의 분리는 분리된 세포에 대한 시험관 내 및 생화학 실험을 수행할 수 있게 해주기 때문에 림프 연구에 중요한 과정입니다. 또한, Cre-lox 기술의 개발은 전 세계적으로 표적화할 수 없는 유전자의 조직 특이적 결핍을 가능하게 하여 연구된 조직에서 유전자의 역할을 정확하게 결정할 수 있게 되었습니다. 림프 생리학 및 병태 생리학에서 특정 유전자의 역할을 해부하려면 림프 특이적 프로모터의 사용이 필요하며, 따라서 표적 유전자의 발현 수준에 대한 실험적 검증이 필요합니다.

야생형 또는 형질전환 마우스에서 림프 내피 세포를 효율적으로 분리하는 방법을 통해 체외 및 시험관 내 분석을 사용하여 림프 기능을 조절하는 메커니즘을 연구하고 연구된 단백질의 발현 수준을 식별할 수 있습니다. 당사는 LYVE-1 발현을 기반으로 하는 마그네틱 비드 정제를 통해 쥐 피부 림프 내피 세포(DLEC)의 효율적인 분리를 위한 프로토콜을 개발, 표준화 및 제시합니다. 요약된 프로토콜은 특히 형광 활성화 세포 분류 장비를 사용할 수 없는 시설에서 림프 내피 세포 기능의 중요한 역할을 더 잘 이해하고 설명할 수 있는 도구를 연구자에게 제공하는 것을 목표로 합니다.

서문

림프계는 인체 생리학에서 중추적인 역할을 합니다. 이는 중요한 항상성 인자로 간주되며, 조직-형질액 균형 유지, 면역 감시, 지질 흡수1와 같은 중요한 기능뿐만 아니라 심장의 복구 능력², 뼈 및 조혈 능력3의 재생 능력과 같은 최근에 확인된 기능을 촉진^합니다. 림프계의 중요한 역할에도 불구하고 림프관의 역할의 여러 측면과 특정 생리학적 매개변수 및 반응을 지배하는 분자 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵습니다. 또한, 림프 혈관 결손은 특정 병태생리학적 상태에서 유발 요인 또는 악화 요인입니다. 잘 알려진 예로는 질병의 유전적 또는 비유전적 원인에 따라 각각 원발성 림프부종과 이차성 림프부종이 있으며, 림프계는 전이를 위한 통로 역할을 하고 면역 기능을 조절하는 역할을 할 수 있기 때문에 원발성 종양 성장 및 전이성 전파에 대한 림프계의 역할은 매우 중요합니다¹.

혈액 혈관에 비해 림프계에 대한 연구 및 지식의 지연은 주로 혈액 혈관 시스템에 비해 림프계가 나중에 발견되고 림프관 특이적 분자 마커의 식별이 지연되기 때문입니다. 이는 최근 수십 년 동안 크게 개선되어 정상 상태와 질병 상태에서의 림프관에 대한 기존의 그림을 변경하게 되었다¹. 혈관신생과 유사하게, 림프관신생술은 기존의 림프관에서 새로운 림프관이 형성되는 것으로, 다양한 질병의 발병에 중추적인 역할을 한다 ^4,5,6. 그러나 혈관신생과 달리 림프관신생에 대한 연구는 주로 in vivo model에 국한되어 있으며, 병리학적 모델의 발달 혈관 형성 및 구조적 결함에 초점을 맞추고 있습니다. 림프 내피 세포의 분리는 시험관 내 연구에 중요하며, 이는 제시된 프로토콜에 의해 제공될 수 있습니다.

마우스에서 림프 내피 분리를 위한 여러 프로토콜이 개발되었으며, 이는 형광 활성화 세포 분류를 필요로 합니다⁷. 세포 분류기의 장점은 사용 가능한 경우 비드 기반 분리와 달리 순도가 더 높으며 비드 기반 분리가 더 높은 수율을 제공한다는 것입니다. 이 프로토콜은 림프관 내 세포 이동에 중요한 림프 내피 마커인 림프 내피 히알루론안 수용체 1(LYVE-1)의 발현을 활용합니다 ^4,8. LYVE-1 발현은 림프관이 수집되는 림프관이 아닌 림프 모세혈관에 국한되기 때문에, 이 기법은 모든 림프내피세포에서 균일하게 발현되는 포도플라닌(podoplanin)과 같은 다른 림프항모세포(marker)와 달리 림프내피세포를 림프혈관에서 특이적으로 분리하는 데 적합하다⁹. 프로토콜의 경우, Prox1과 같이 막관통이 아닌 다른 중요한 림프 마커는 제외되었습니다.

생리학적 결과는 일반적으로 림프 모세혈관에서 시작되는 림프관 형성이었기 때문에 LYVE-1은 이러한 세포에서 선택성이 있고 선택된 항체가 높은 수율을 제공하기 때문에 표적으로 선택되었습니다. 사용된 효소는 일반적으로 I형¹⁰보다 콜라겐 해리에 더 효과적인 것으로 알려진 콜라겐 분해효소 II형과 진피-표피 분리에 정기적으로 사용되는 더 넓은 프로테아제인 디스파제(dispase)였다¹¹; 그러나, 조직 분리를 위한 다른 효소는^12,13 보고되었으며 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 특히 형광 활성화 세포 분류가 쉽게 가능하지 않은 장소에서 마그네틱 비드 정제를 사용하여 높은 수율로 성인 마우스의 림프 모세혈관에서 피부 림프 내피 세포를 분리하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 림프 내피 세포의 순도가 다운스트림 응용 분야를 위해 손상될 수 있는 응용 분야에 적합합니다.

프로토콜

동물 연구는 TTUHSC 실험에 대해 텍사스 공과 대학 보건 과학 센터(TTUHSC)의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었으며, 파트라스 대학의 실험에 대한 지침 2010/63에 따라 서부 그리스 현의 수의국(Veterinary Administration of the Prefecture of Western Greece)에서 수행했습니다. 동물 배설물을 처리할 때는 폐기물 처리 규정을 성실히 준수하십시오.

1. 마우스 진피의 격리

1. 1일차
   참고: 1일차; 마취실, 동물 이발기, 이소플루란, 미세 겸자, 0.2μm 주사기 필터와 같은 재료 및 장비를 준비하십시오.
   1. DMEM에 1x Antibiotic-Antimycotic Solution과 함께 2mg/mL Dispase 용액을 준비하고 필터 멸균합니다.
      참고: 매체 또는 PBS의 사용은 보고된 다른 프로토콜¹²에서 성공적으로 사용되었기 때문에 HBSS로 대체될 수 있습니다. 1x 항생제-항진균 용액은 페니실린(100 IU/mL), 스트렙토마이신(100 μg/mL) 및 암포테리신(2.5 μg/mL)을 첨가하여 대체할 수 있습니다.
   2. 이소플루란(0.5-2% 이소플루란, 유량: 1L/min)이 투여된 마취실에 마우스를 넣어 마우스를 마취합니다. 마우스가 움직임을 멈춘 후 케이지 밖으로 옮기고 유사한 이소플루란 흐름으로 노즈 콘을 조정하는 마취를 계속합니다. 동물을 발가락으로 꼬집어 충분한 마취 수준을 확인하고 쥐를 지속적으로 모니터링하여 깊은 마취가 보존되도록 합니다(운동성 없음). 이발기를 사용하여 등쪽과 복부 털(각각 쥐 등과 복부)을 정중선을 따라 세로로 약 9cm² 를 자릅니다. 쥐가 마취에서 회복되어 케이지로 되돌려 놓습니다.
      참고: 제모(제모) 크림을 대신 사용할 수 있습니다. 피부의 무결성을 유지하면서 격리할 피부 부위의 털이 완전히 제거되었는지 확인하십시오. 가능한 한 확장된 피부 부위를 클리핑하십시오. 제모로 인한 잠재적인 염증이 해결되도록 하려면 다음 날 세포 분리를 해야 합니다. 고립된 세포의 수를 늘리려면 그룹당 2-4개의 마우스를 풀합니다.
2. 2일차
   참고: 안락사 챔버, 생물 안전 캐비닛, CO₂ 인큐베이터, 에탄올, 미세 가위, 미세 집게, 무딘 집게, 100mm 조직 배양 플레이트, Dispase, DMEM, 1x 항생제-항진균 용액.
   1. CO₂ 투여로 마우스를 안락사시키고 누운 자세로 놓아 잘린 부위를 노출시킵니다. 70% 에탄올을 소독제로 뿌립니다.
      참고: 이 단계부터 모든 단계는 멸균 조건(생물 안전 캐비닛에서)에서 수행해야 합니다.
   2. 멸균된 100mm 조직 배양 플레이트를 얼음 위에 놓습니다.
   3. 복부를 0.5인치 표면 절삭하고 정중선을 따라 목과 하복부까지 세로로 자릅니다. 피부를 플랩으로 열 수 있도록 측면 절단을 하십시오.
      참고: 절개 크기와 격리된 피부 면적은 마우스 크기에 따라 다릅니다.
   4. 뭉툭한 집게를 사용하여 주변 조직과 피부를 조심스럽게 분리합니다. 쥐의 몸통 전체를 돌아 다니며 목과 하복부 주변의 피부를 측면으로 자릅니다.
   5. 진피 쪽이 아래를 향하도록 하여 피부를 100mm 조직 배양 플레이트에 조심스럽게 넣어 피부를 최대한 늘려 줍니다. 접시를 덮고 얼음 위에 보관하십시오. 그룹에서 모든 마우스의 격리를 완료합니다.
   6. 모든 마우스에서 피부를 추출한 후 실온에서 10분 동안 플레이트를 배양하여 이식을 평평하게 합니다.
   7. 접시에 Dispase 용액 6mL를 넣고 피부가 완전히 잠기도록 하고 4°C에서 가벼운 교반으로 밤새 배양합니다.
      참고: Dispase 대신 트립신 소화를 수행할 수도 있으며,¹² 콜라겐분해효소 Type II 처리(아래) 대신 Liboroughase를 수행할 수 있습니다.

2. 진피에서 세포 분리

1. 3일차
   참고: 원심분리기, CO₂ 인큐베이터, 생물 안전 작업대, 가위, DMEM, 1x 항생제-항진균 용액, 콜라겐 분해 효소 유형 II, PBS, 50mL 코니컬 튜브, 100mm 및 60mm 조직 배양 플레이트, DNAse I 용액, 콜라겐 유형 I, 70μm 및 40μm 세포 여과기, 0.2μm 주사기 필터, LEC 배지.
   1. 500mL의 1x PBS(1.37M NaCl, 27mM KCl, 100mM Na₂HPO₄, 18mM KH₂PO₄, pH 7.4)를 준비하고 15psi에서 20분 동안 오토클레이브하거나 필터 멸균합니다. 또는 시중에서 판매되는 멸균 PBS를 사용하십시오.
   2. DMEM에 1x 항생제-항진균성 용액과 함께 10mL의 2mg/mL 콜라겐분해효소 II 용액을 준비하고 필터 멸균합니다.
      참고: 멸균 후드 아래에서 다음 단계를 수행하여 샘플 오염 가능성을 줄이십시오.
   3. 피펫을 사용하여 접시에서 액체를 제거하십시오.
   4. 겸자를 사용하여 진피(피부 하단)와 표피(상단)를 분리하고 명백한 지방 조직을 제거합니다. 진피를 깨끗한 조직 배양 플레이트로 옮깁니다.
   5. 깨끗한 조직 배양 플레이트에 DMEM 1mL와 1x 항생제-항진균 용액을 넣고 액체가 플레이트의 한쪽 면에 쌓이도록 기울입니다.
   6. 진피를 1-2mm² 조각으로 다져 새로운 50mL 원추형 튜브로 옮깁니다.
      참고: 이 단계는 이상적으로 4-5분 이내에 완료해야 하며, 더 긴 처리는 더 높은 수율이나 세포 생존을 제공할 것으로 예상되지 않으므로 가능합니다.
   7. 콜라겐분해효소 II형 용액 10mL를 추가합니다.
   8. DNAse I 용액 50μL(용액 25단위/mL)를 추가하고(세포 응집 감소) 연속 교반으로 37°C에서 2시간 동안 진피 용액을 분해합니다(30-50rpm에서 회전/진탕 인큐베이터 사용).
      알림: 대부분의 진피가 소화되었는지 주기적으로 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 가능하면 소화 시간(최대 1시간 추가)과 교반 속도를 높입니다.
   9. 60mm 조직 배양 플레이트에 0.02m 아세트산에 10μg/mL 콜라겐 유형 I 2mL를 37°C에서 >20분 동안 코팅합니다. 멸균 PBS로 2회 세척하십시오.
   10. 70μm 셀 스트레이너와 원심분리기를 사용하여 250× g 에서 5분 동안 셀 현탁액을 여과합니다. 상층액을 버립니다.
   11. 1x 항생제-항진균 용액으로 DMEM 10mL에 재현탁합니다.
   12. 40μm 셀 스트레이너와 원심분리기를 사용하여 250× g 에서 5분 동안 셀 현탁액을 여과합니다. 상층액을 버립니다.
   13. 1mL의 완전한 LEC 배지(Endothelial Cell Growth Base Medium with Supplement)에 재현탁합니다.
   14. 콜라겐 코팅된 60mm 조직 배양 플레이트의 세포를 완전한 LEC 배지에 패팅합니다. 이것은 세포 배양의 0일차입니다.
   15. 2일마다 1x PBS로 세포를 두 번 세척하고 새 LEC 배지를 추가하여 배지를 교체합니다.
   16. 셀이 80-90% 합류할 때까지 2.1.15단계를 반복합니다.
       참고: 세포가 80-90% 합류하기 전에 정제를 수행하면 더 적은 수의 림프 내피 세포가 분리됩니다. 이 과정은 약 7일에서 10일 정도 걸립니다.

3. LYVE-1 항체를 이용한 마그네틱 비드 코팅

참고: 정제 단계 하루 전에 4 °C 냉장고, 로터, 자기 분리기, PBS, Anti-Rabbit IgG 마그네틱 비드, 마이크로 원심분리기 튜브, 0.2 μm 주사기 필터, 마그네틱 비드 코팅 용액, LYVE-1 항체.

1. 마그네틱 비드 코팅 용액 준비: 0.1% BSA 및 2mM EDTA가 있는 PBS 20mL를 준비하고 필터 멸균합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
   알림: 며칠 이상의 보관은 권장되지 않습니다. 사용하기 전에 침전물이나 오염이 있는지 확인하십시오.
2. 500μL의 Anti-Rabbit IgG 마그네틱 비드를 마이크로 원심분리기 튜브에 피펫팅하고 1mL의 얼음처럼 차가운 마그네틱 비드 코팅 용액을 추가합니다.
3. 자기 분리기를 사용하여 구슬을 씻으십시오.
4. 얼음처럼 차가운 Magnetic Bead Coating Solution 1mL로 2회 세척을 반복합니다.
5. 500 μL의 마그네틱 비드 코팅 용액에 비드를 재현탁시키고 마이크로 원심분리기 튜브에서 150 μL의 부분 표본을 만듭니다.
6. 각 튜브에 LYVE-1 항체 15μg을 추가합니다(1mg/mL 항체 스톡 농도에서 15μL).
7. 연속 교반으로 4 °C에서 밤새 배양합니다.

4. 림프 내피 세포 정제

참고: CO₂ 인큐베이터, 쉐이커, 타이머, 파라필름, DMEM, 1x 항생제-항진균 용액, BSA, PBS, 마그네틱 비드 코팅 용액, 트립신-EDTA, 100mm 또는 60mm 조직 배양 플레이트, 0.2μm 주사기 필터, 콜라겐 유형 I, 아세트산, LEC 배지.

1. 50mL의 DMEM에 1x 항생제-항진균 용액과 0.1% BSA를 넣고 필터 멸균합니다.
2. 37°C에서 >20분 동안 0.02m 아세트산에 10μg/mL 콜라겐 유형 I을 60mm 조직 배양 플레이트에 코팅합니다. 멸균 PBS로 2회 세척하십시오.
3. 자기 분리기를 사용하여 1mL의 Magnetic Bead Coating Solution으로 사전 코팅된 비드를 세척합니다.
4. 0.1% BSA로 150μL의 DMEM에 비드를 재현탁시킵니다.
   참고: 비드는 이제 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
5. PBS로 세포를 2번 세척합니다.
6. 0.1% BSA(60mm 조직 배양 플레이트용)가 포함된 DMEM 3mL와 항체 접합 비드 50μL를 세포에 추가합니다.
   참고: 두 개 이상의 마우스의 세포가 합쳐진 경우 100mm 조직 배양 플레이트를 사용하고 0.1% BSA가 포함된 6mL의 DMEM을 추가합니다.
7. 파라필름으로 접시를 밀봉합니다.
8. RT에서 10RPM으로 교반하는 셰이커에 접시를 놓고 정확히 10분 동안 배양합니다.
   참고: 배양이 길어지면 비특이적 결합이 발생합니다. 비드가 전체 플레이트 표면과 상호 작용하도록 하려면 계속 흔들리면서 몇 분마다 플레이트를 수동으로 회전시킵니다.
9. 매체를 버리고 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 세포를 신속하게 검사하여 플레이트에 LEC 콜로니가 있는지 확인합니다.
10. 트립신화 세포: 트립신-EDTA 1mL를 사용하고 37°C에서 3분 동안 배양합니다. 성공적인 세포 분리를 위해 세포를 검사합니다.
11. 2mL의 완전한 LEC 배지로 용액을 중화하고 용액을 5mL 멸균 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.
12. 자기 분리기를 사용하여 0.1% BSA가 있는 4 x 3mL의 DMEM을 세척하여 결합되지 않은 세포를 제거합니다.
13. 나머지 비드 결합 세포를 완전한 LEC 배지에 재현탁시키고 이전에 콜라겐 코팅된 60mm 조직 배양 플레이트에 플레이트합니다.
14. 37°C에서 세포를 배양하고 매번 두 번의 PBS 세척 후 격일로 배지를 교체합니다.
15. 밀도에 도달할 때까지 세포를 배양합니다(일반적으로 7-10일 소요).
16. 이 시점에서 현미경으로 세포가 밀도가 있는지 확인하고 유세포 분석을 위한 세포 준비를 진행합니다. 높은 F4/80+ 비율이 확인되면 LYVE-1(4단계: 림프 내피 세포 정제)로 정제 단계를 다시 반복하거나 다른 림프 마커(예: 포도플라닌¹⁴)를 사용하는 것이 좋습니다.
    참고: 마그네틱 비드 정제 세포 집단에서 항체에 의해 표적으로 하는 단백질의 높은 발현은^15,16으로 입증되었습니다. 그러나 LYVE-1의 경우 다른 LYVE-1+ 세포(대부분 대식세포)의 비율을 식별하기 위해 유세포 분석 제어를 수행하는 것이 중요합니다. LYVE-1은 종양 및 상처와 관련된 대식세포의 부분집합에서만 발현되는 반면, 건강한 피부에서 LYVE-1 발현은 림프내피세포에 더 국한된다¹⁷. 따라서 F4/80 스크리닝은 필수가 아니라 실험 상황에 따라 달라집니다. 시연에 사용된 마우스는 종양이나 상처를 가지고 있지 않았고 제모로 인한 잠재적인 염증만 가지고 있었지만 LYVE-1+ 대식세포 비율의 기준선으로 F4/80 염색을 포함했습니다.

5. 유세포 분석

참고: 원심분리기, CO₂ 인큐베이터, 타이머, 혈구계, EDTA 용액, 1x 항생제-항진균 용액, BSA, PBS, 트립신-EDTA, 폴리프로필렌 튜브, 0.2μm 주사기 필터, 70% 에탄올, F4/80 FITC-복합 항체.

1. 0.1% BSA가 함유된 PBS를 준비하고 필터 살균합니다.
2. PBS에서 1mM EDTA 용액을 준비합니다.
3. 세포 트립신화: 37°C에서 5분 동안 1mL EDTA 용액 1mL로 세포를 배양합니다.
   참고: EDTA 용액을 사용한 배양은 세포막 관통 단백질을 더 잘 보존하는 더 가벼운 세포 분리 방법이며 선호되지만 더 긴 배양 기간이 필요합니다. 또는 trypsin-EDTA 용액을 37°C에서 1분 배양에 사용할 수 있지만, 이는 유세포 분석 응용 분야의 항체 친화도에 영향을 미칠 수 있습니다.
4. 2mL의 완전한 LEC 배지로 용액을 중화하고 용액을 5mL 멸균 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.
5. 샘플을 250× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
6. PBS로 씻으십시오.
7. 원심분리와 PBS 세척을 반복합니다.
8. 0.1% BSA를 함유한 PBS의 세포를 재현탁시키고 혈구계 또는 대체 방법을 사용하여 계수합니다. 최종 부피가 100 μl인 폴리프로필렌 튜브에 ~1 × 10⁶ 세포를 분취합니다. 이 단계부터 4°C에서 모든 단계를 수행합니다.
   참고: 세포는 염색하기 전에 고정하거나 살아있는 동안 염색할 수 있습니다. 일부 항체는 고정 후 항원을 검출하지 못할 수 있으므로 유세포 분석에는 고정이 최적화되지 않을 수 있습니다. 따라서 이전 단계 직후에 유세포 분석을 실행하고 고정 단계를 건너뛰는 것이 좋습니다. 이것이 가능하지 않은 경우, 유세포 분석 실험 전에 고정하면 유세포 분석 단계를 지연시킬 수 있습니다. 고정을 수행해야 하는 경우, 고정된 세포의 맥락에서 항체의 성능을 미리 평가해야 합니다.
9. 고정 수행(선택적 단계, 세포가 고정되지 않을 경우 면역염색 진행): 세포를 얼음처럼 차가운 70% 에탄올에 재현탁시키고 얼음 위에서 10분 동안 부드럽게 혼합합니다.
   참고 : 에탄올 고정은 세포를 투과 화하고 GFP의 방출로 이어질 수 있습니다. 그러나 파라포름알데히드 기반 고정은 유세포 분석에 사용되는 염료를 파괴할 수 있으며 이상적으로는 피할 수 있습니다.
10. 실온에서 15분 동안 배양합니다.
11. 250× g 에서 원심분리로 세포를 2x PBS에서 5분 동안 1회 세척합니다.
12. 다음 단계로 진행하거나 1x PBS 0.5-1mL에 세포를 재현탁시키고 4°C에서 보관합니다.

6. 면역염색

참고: 세포를 부드럽게 다루고 가능한 경우 광범위한 피펫팅을 피하여 세포막의 무결성을 유지하고 세포 사멸을 최소화하여 세포가 덩어리를 형성하지 않도록 하십시오. 분리된 내피 세포에서 염색되지 않은 세포 및 다른 내피 세포 마커(즉, VEGFR3, 포도플라닌), F4/80 및 둘 다를 사용하여 염색된 세포를 준비합니다. 상업적으로 이용 가능한 마우스 림프 내피 세포와 대식세포(사용 가능한 경우)를 양성 대조군으로 포함합니다. 시연을 위해 내인성 tdTomato 형광(PE+)으로 인해 FITC-conjugated F4/80 염색을 사용했습니다.

1. 권장되거나 최적화된 희석에 따라 PBS의 1차 항체를 0.1% BSA로 희석합니다. 0.5μg(1μL의 항체 용액)의 F4/80 FITC 복합 항체를 세포 현탁액 100μL에 추가합니다.
2. 희석된 형광 접합 항체를 첨가한 후 세포를 재현탁시킵니다. 폴리프로필렌 튜브를 튕겨 덩어리가 없고 모든 셀이 제대로 코팅되었는지 확인합니다.
3. 실온(고정 세포)에서 1시간 동안 배양하거나 어두운 곳에서 얼음(살아있는 세포)에서 30분 동안 배양합니다.
4. 어두운 곳에서 0.1% BSA의 PBS를 사용하여 250× g 에서 4°C(살아있는 세포의 경우) 또는 실온(고정 세포의 경우)에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 2배 세척합니다.
5. non-fluorescently-conjugated antibodies(non-fluorescently-conjugated 항체)용
   1. fluorochrome-conjugated secondary antibody를 배양 완충액에 희석합니다. Alexa Flour 항체의 경우 1:500 희석을 사용합니다.
   2. 세포 현탁액 100μL에 2차 항체를 추가합니다.
   3. 실온(고정 세포) 또는 얼음(살아있는 세포)에서 30분 동안 배양합니다.
   4. 배양 완충액에서 250 × g 의 원심분리를 통해 4°C(살아있는 세포의 경우) 또는 실온(고정 세포의 경우)에서 5분 동안 2회 세척합니다.
6. 1x PBS 0.5mL에 세포를 재현탁하고 유세포분석기를 사용하여 분석합니다.
7. 다음 gating 전략 단계에 따라 LYVE-1 발현 세포 내 대식세포 집단을 식별하십시오.
   1. 세포 집단을 구별하기 위해 전방 및 측면 산란을 고려하십시오.
   2. 단일 세포(Singlet)를 구별하기 위해 셀 크기, 면적 및 높이에 대한 전방 산란을 고려하십시오.
   3. F4/80(FITC) 발현 및 RFP(PE) 발현을 고려하여 tdTomato(PE) 발현 분리된 쥐 세포 내에서 대식세포(F4/80+)를 식별합니다(아래에 설명된 특정 마우스에 형광 tdTomato 리포터가 존재하기 때문에).

결과

이 방법은 작은 GTPase, RhoA의 단백질 발현을 확인하기 위해 개발되었으며, 이 코딩 유전자는 두 대립유전자에서 모두 플록화되어 타목시펜 유도 림프 내피 특이적 프로모터 Prox1-CreER^{T2 18}의 영향으로 삭제되었습니다. 분리된 LEC는 최대 4세대 동안 배양할 수 있으며, 그 후에는 노화가 됩니다. 그들은 얼고, 해동되고, 안지오포이에틴-2로 성공적으로 자극되었습니다. ?...

토론

림프계는 신체의 항상성 기능을 조절하는 중요한 조절자이며, 가장 중요한 기능은 유체 혈장 유지, 세포 대사 부산물 및 독성 분자 제거, 지질 흡수 및 면역 세포 이동입니다 ^1,19. 적절한 마커의 식별은 림프관 분야에서 새로운 데이터의 폭발을 불러 일으켰으며, 특정 장기의 복구 및 재생 능력에 대한 역할과 같은 림프 혈관의 새로운 기능을 밝혀 냈습?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Syringe Filters	Fisher Scientific	09-719C
100 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012924
60 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012921
Animal Hair Clipper	Wahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100x	Fisher Scientific	15240-062
Blunt Forceps	Fine Science Tools	11992-20
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4919
Cell Strainer 40 μm	Fisher Scientific	542040
Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat Tail	Corning	354249	dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O
Collagenase Type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM	Fisher Scientific	11-995-073
DNAse I Solution (2,500 U/mL)	Thermo Scientific	90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator	Invitrogen	120-21D
EDTA	Sigma-Aldrich	3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium)	R&D Systems	CCM027
Euthanasia chamber	Euthanex Corporation
Fine Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Fine Scissors-Sharp	Fine Science Tools	14060-10
FITC anti-mouse F4/80 Antibody	Biolegend	123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads	New England Biolabs	S1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber	Euthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads	Thermo Scientific	21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS	Fisher Scientific	AAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	SH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1	ReliaTech GmbH	103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene Tubes	Corning	352063
Syringe Filters w 0.2 μm Pores	Fisher Scientific	09-719C
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25-300-120