Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל מורין מנימי לימפה עוריים. תאי האנדותל הלימפטיים המבודדים יכולים לשמש לניסויים במבחנה במורד הזרם ולניתוח ביטוי חלבונים.

Abstract

מערכת הלימפה משתתפת בוויסות המעקב החיסוני, ספיגת שומנים ואיזון נוזלים ברקמות. הבידוד של תאי אנדותל לימפטיים מורין הוא תהליך חשוב למחקר הלימפה, שכן הוא מאפשר ביצוע ניסויים חוץ גופיים וביוכימיים על התאים המבודדים. יתר על כן, הפיתוח של טכנולוגיית Cre-lox איפשר מחסור ספציפי לרקמות של גנים שלא ניתן למקד באופן גלובלי, מה שהוביל לקביעה מדויקת של תפקידם ברקמות הנחקרות. דיסקציה של תפקידם של גנים מסוימים בפיזיולוגיה הלימפטית ובפתופיזיולוגיה דורשת שימוש במקדמים ספציפיים ללימפה, ולפיכך, אימות ניסיוני של רמות הביטוי של הגנים הממוקדים.

שיטות לבידוד יעיל של תאי אנדותל לימפטיים מעכברי בר או עכברים טרנסגניים מאפשרות שימוש בבדיקות ex vivo ו - in vitro כדי לחקור את המנגנונים המווסתים את תפקודי הלימפה ואת זיהוי רמות הביטוי של החלבונים הנחקרים. פיתחנו, תקננו והצגנו פרוטוקול לבידוד יעיל של תאי אנדותל לימפטיים עוריים (DLECs) באמצעות טיהור חרוזים מגנטי המבוסס על ביטוי LYVE-1. הפרוטוקול המתואר נועד לצייד את החוקרים בכלי להבנה נוספת ולהבהרה של שחקנים חשובים של תפקודי תאי אנדותל לימפה, במיוחד במתקנים שבהם ציוד מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות אינו זמין.

Introduction

מערכת הלימפה ממלאת תפקיד מרכזי בפיזיולוגיה האנושית. זה נחשב גורם הומיאוסטטי חיוני, המאפשר פונקציות חשובות, כגון שמירה על איזון נוזל רקמות-פלזמה, מעקב חיסוני, ספיגת שומנים1, כמו גם פונקציות שזוהו לאחרונה, כגון יכולת התיקון של הלב2 ואת יכולת התחדשות של עצם hematopoiesis3. למרות התפקיד המשמעותי של מערכת הלימפה, מספר היבטים של תפקיד הלימפה, כמו גם המנגנונים המולקולריים השולטים בפרמטרים פיזיולוגיים מסוימים ובתגובות נותרו חמקמקים. יתר על כן, פגמים בכלי הלימפה הם גורמים מפעילים או מתדרדרים במצבים פתופיזיולוגיים מסוימים. דוגמאות ידועות הן הלימפאדמה הראשונית והמשנית, בהתאם למקור הגנטי או הלא גנטי של המחלה, בהתאמה, בעוד שתפקידה של מערכת הלימפה על צמיחת הגידול הראשונית והפצה גרורתית הוא מרכזי, שכן הוא יכול לשמש צינור לגרורות ומודולטור של תפקודי החיסון1.

הפיגור במחקר ובידע של הלימפה בהשוואה לכלי הדם נובע בעיקר מגילוי מאוחר יותר של מערכת הלימפה בהשוואה למערכת כלי הדם והעיכוב בזיהוי סמנים מולקולריים ספציפיים ללימפה. זה השתפר מאוד בעשורים האחרונים, מה שהוביל לשינוי התמונה הקונבנציונלית של הלימפה במצב יציב ובתנאים חולים1. בדומה לאנגיוגנזה, לימפנגיוגנזה היא היווצרות כלי לימפה חדשים מאלו הקיימים וממלאת תפקיד מרכזי בהתפתחות קשת רחבה של מחלות 4,5,6. עם זאת, בניגוד לאנגיוגנזה, חקירת הלימפנגיוגנזה הוגבלה בעיקר למודלים in vivo המתמקדים בהיווצרות כלי דם התפתחותיים ופגמים מבניים במודלים פתולוגיים. הבידוד של תאי אנדותל הלימפה חשוב למחקרי מבחנה, וזה יכול להיות מסופק על ידי הפרוטוקול המוצג.

פותחו מספר פרוטוקולים לבידוד אנדותל לימפתי מעכברים, המחייבים שימוש במיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות7. היתרון של ממיין התאים, כאשר זמין, הוא דרגת טוהר גבוהה יותר, בניגוד לבידוד מבוסס חרוזים, כאשר האחרון מספק תפוקה גבוהה יותר. הפרוטוקול משתמש בביטוי של קולטן לימפתי אנדותל היאלורונן 1 (LYVE-1), סמן אנדותל לימפטי, החשוב לסחר בתאים בתוך כלי הלימפה 4,8. מכיוון שביטוי LYVE-1 מוגבל לנימי הלימפה ולא לכלי הלימפה האוספים, הטכניקה מתאימה לבידוד תאי אנדותל לימפטיים דווקא מהנימים הלימפטיים בניגוד לסמנים לימפטיים אחרים, כגון פודופלנין, המתבטאים באופן אחיד בכל תאי האנדותל הלימפטיים9. עבור הפרוטוקול, סמנים לימפטיים חשובים אחרים שלא היו transmembrane, כגון Prox1, נשללו.

מכיוון שהתוצאה הפיזיולוגית הייתה לימפנגיוגנזה, המופעלת בדרך כלל בנימי הלימפה, LYVE-1 נבחר כמטרה בשל הסלקטיביות שלו בתאים אלה ומכיוון שהנוגדן שנבחר סיפק תפוקה גבוהה. האנזימים בהם נעשה שימוש היו collagenase type II, הידוע בדרך כלל כיעיל יותר בדיסוציאציה של קולגן מאשר סוג I10, ו-dispase, פרוטאז רחב יותר, המשמש באופן קבוע להפרדת דרמיס-אפידרמיס11; עם זאת, אנזימים אחרים להפרדת רקמות דווחו12,13 וניתן להשתמש בהם. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר שיטה לבידוד תאי אנדותל לימפטיים עוריים מנימי לימפה של עכברים בוגרים בעלי תפוקה גבוהה באמצעות טיהור חרוזים מגנטיים, במיוחד במקומות שבהם מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות אינו זמין. השיטה מתאימה ליישומים שבהם טוהר תאי האנדותל הלימפטיים עלול להיפגע עבור יישומים במורד הזרם.

Protocol

מחקרים בבעלי חיים בוצעו על פי הפרוטוקולים המאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס טק (TTUHSC) עבור הניסויים ב- TTUHSC ועל ידי המנהל הווטרינרי של מחוז מערב יוון על פי הנחיה 2010/63 לניסויים באוניברסיטת פטרס. יש להקפיד על תקנות סילוק פסולת בעת השלכת חומרי פסולת בעלי חיים.

1. בידוד של דרמיס עכבר

  1. יום 1
    הערה: ביום הראשון; הכינו את החומרים והציוד הבאים: תא הרדמה, קוצץ שיער לבעלי חיים, איזופלורן, מלקחיים עדינים, מסנני מזרק 0.2 מיקרומטר.
    1. הכינו תמיסת דיספז 2 מ"ג/מ"ל ב-DMEM עם 1x Antibiotic-Antimycotic Solution וסננו-עיקרו אותה.
      הערה: השימוש במדיום או PBS יכול להיות מוחלף על ידי HBSS, כפי שנעשה בו שימוש בהצלחה בפרוטוקולים אחרים שדווחו12. ניתן להחליף את התמיסה האנטיביוטית-אנטי-מיקוטית 1x על ידי תוספת של פניצילין (100 יב"ל/מ"ל), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל) ואמפוטריצין (2.5 מיקרוגרם/מ"ל).
    2. מרדימים את העכבר על ידי הנחת העכבר בתא הרדמה עם מתן איזופלורן (0.5-2% איזופלורן, זרימה: 1 ליטר/דקה). לאחר שהעכבר מפסיק לנוע, העבירו אותו אל מחוץ לכלוב, והמשיכו בהרדמה בהתאמת חרוט אף עם זרימת איזופלורן דומה. צבטו את בעל החיים כדי לוודא רמות הרדמה מספיקות ועקבו כל הזמן אחר העכבר כדי להבטיח שהרדמה עמוקה נשמרת (ללא תנועתיות). יש לקצץ כ-9 ס"מ2 של הפרווה הגבית והגחונית (גב העכבר והבטן בהתאמה) לאורך קו האמצע, באמצעות קוצץ שיער. תנו לעכבר להתאושש מההרדמה והחזירו אותו לכלוב.
      הערה: ניתן להשתמש במקום זאת בקרם להסרת שיער (depilation). יש לוודא שהפרווה מוסרת לחלוטין באזורי העור כדי לבודד אותה תוך שמירה על שלמות העור. נסו לגזור את אזור העור המורחב ככל האפשר. כדי להבטיח שהדלקת הפוטנציאלית מהסרת השיער תיפתר, בידוד התאים חייב להתבצע למחרת. כדי להגדיל את מספר התאים המבודדים, מאגר 2 עד 4 עכברים בכל קבוצה.
  2. יום 2
    הערה: שמור את החומרים והציוד הבאים מוכנים: תא המתת חסד, ארון בטיחות ביולוגית, אינקובטור CO2 , אתנול, מספריים עדינים, מלקחיים עדינים, מלקחיים קהים, צלחת תרבית רקמות 100 מ"מ, Dispase, DMEM, 1x פתרון אנטיביוטי-אנטימיקוטי.
    1. הרדימו את העכבר על ידי מתן CO2 והניחו אותו במצב שכיבה, תוך חשיפת האזור החתוך. יש לרסס 70% אתנול כחומר חיטוי.
      הערה: משלב זה ואילך, כל השלבים חייבים להתבצע בתנאים סטריליים (בארון בטיחות ביולוגית).
    2. מניחים צלחת תרבית רקמות סטרילית בקוטר 100 מ"מ על קרח.
    3. בצע חתך שטחי של 0.5 אינץ 'בבטן וחתך לאורך קו האמצע לצוואר ולבטן התחתונה. בצע חתכים לרוחב כדי להיות מסוגל לפתוח את העור.
      הערה: גודל החתך ואזור העור המבודד תלויים בגודל העכבר.
    4. באמצעות מלקחיים קהים, להפריד בזהירות את העור מן הרקמות שמסביב. לעשות את זה הולך סביב כל פלג הגוף העליון של העכבר, לחתוך את העור לרוחב סביב הצוואר ואת הבטן התחתונה.
    5. הניחו בזהירות את העור לתוך צלחת תרבית רקמות בקוטר 100 מ"מ, כאשר צד הדרמיס פונה כלפי מטה, תוך שמירה על העור מתוח ככל האפשר. מכסים את הצלחות ושומרים אותן על קרח. להשלים את הבידוד של כל העכברים מהקבוצה.
    6. לאחר מיצוי העור מכל העכברים, דגרו על צלחות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשטח את החציל.
    7. הוסיפו 6 מ"ל של תמיסת דיספז לצלחת, וודאו שהעור שקוע לחלוטין ודגרו למשך הלילה עם תסיסה קלה ב-4°C.
      הערה: במקום Dispase, ניתן לבצע גם עיכול טריפסין12, ואחריו Liberase במקום טיפול Collagenase Type II (להלן).

2. בידוד תאים מהדרמיס

  1. יום 3
    הערה: שמור את החומרים והציוד הבאים מוכנים: צנטריפוגה, אינקובטור CO2 , ארון בטיחות ביולוגית, מספריים, DMEM, 1x פתרון אנטיביוטי-אנטימיקוטי, Collagenase סוג II, PBS, צינור חרוטי 50 מ"ל, לוחות תרבית רקמה 100 מ"מ ו 60 מ"מ, תמיסת DNAse I, קולגן סוג I, 70 מיקרומטר ו 40 מיקרומטר מסננות תאים, מסנני מזרק 0.2 מיקרומטר, מדיום LEC.
    1. הכינו 500 מ"ל של 1x PBS (1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4, pH 7.4) ו-autoclave למשך 20 דקות ב-15 psi או חיטוי מסנן. לחלופין, השתמש PBS סטרילי זמין מסחרית.
    2. הכינו 10 מ"ל של תמיסת 2 מ"ג/מ"ל Collagenase Type II ב-DMEM עם 1x Antibiotic-Antimycotic Solution וסננו אותה.
      הערה: בצע את השלבים הבאים מתחת למכסה מנוע סטרילי כדי להקטין את הסיכויים לזיהום דגימה.
    3. השתמשו בפיפטה כדי להסיר את הנוזלים מהמנה.
    4. השתמש במלקחיים כדי להפריד את הדרמיס (החלק התחתון של העור) מהאפידרמיס (העליון) ולהסיר כל רקמת שומן ברורה. מעבירים את הדרמיס לצלחת תרבית רקמות נקייה.
    5. הוסף 1 מ"ל DMEM עם 1x תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית בצלחת תרבית הרקמה הנקייה והטה אותה כך שהנוזל יצטבר בצד אחד של הצלחת.
    6. טוחנים את הדרמיס לתוך 1-2 מ"מ2 חתיכות ומעבירים אותם לצינור חרוטי חדש 50 מ"ל.
      הערה: שלב זה חייב להסתיים באופן אידיאלי תוך 4-5 דקות, מכיוון שעיבוד ארוך יותר אינו צפוי לספק תפוקה גבוהה יותר או הישרדות תאים.
    7. הוסף 10 מ"ל של תמיסת Collagenase Type II.
    8. הוסף 50 μL (25 יחידות / מ"ל של התמיסה) של תמיסת DNAse I (מפחית גושי תאים) ולעכל את תמיסת הדרמיס במשך 2 שעות ב 37 ° C עם תסיסה מתמשכת (להשתמש אינקובטור מסתובב / רועד ב 30-50 סל"ד).
      הערה: בדוק מעת לעת כדי לזהות אם רוב הדרמיס התעכל. אם לא, להגדיל את זמן העיכול (1 שעה נוספת מקסימום) ואת מהירות התסיסה, אם אפשר.
    9. ציפוי 60 מ"מ צלחות תרבית רקמה עם 2 מ"ל של 10 מיקרוגרם/מ"ל קולגן סוג I בחומצה אצטית 0.02 מ' למשך >20 דקות ב-37°C. יש לשטוף 2x עם PBS סטרילי.
    10. סנן את תרחיף התא באמצעות מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר וצנטריפוגה במשקל 250 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
    11. השהה מחדש ב 10 מ"ל של DMEM עם 1x פתרון אנטיביוטי-אנטי-מיקוטי.
    12. סנן את מתלה התא באמצעות מסננת תאים 40 מיקרומטר וצנטריפוגה ב 250 × גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
    13. יש להשהות מחדש ב-1 מ"ל של מדיית LEC מלאה (בסיס גידול תאי אנדותל בינוני עם תוסף).
    14. לוחים את התאים בצלחת תרבית רקמה בקוטר 60 מ"מ מצופה קולגן במדיית LEC מלאה. זה יהיה יום 0 של תרבית תאים.
    15. החלף את המדיה לאחר כל יומיים על ידי שטיפת תאים עם PBS 1x פעמיים והוספת מדיה LEC טרי.
    16. חזור על שלב 2.1.15 עד שהתאים נפגשים 80-90%.
      הערה: אם הטיהור מתבצע לפני שהתאים נפגשים ב-80-90%, פחות תאי אנדותל לימפטיים יבודדו. תהליך זה אורך כ-7 עד 10 ימים.

3. ציפוי חרוזים מגנטי עם נוגדן LYVE-1

הערה: יום לפני שלב הטיהור, הכינו את החומרים והציוד הבאים: מקרר 4°C, רוטור, מפריד מגנטי, PBS, חרוזים מגנטיים IgG נגד ארנבות, צינורות מיקרוצנטריפוגה, מסנני מזרק 0.2 מיקרומטר, תמיסת ציפוי חרוזים מגנטית, נוגדן LYVE-1.

  1. הכינו את תמיסת ציפוי החרוזים המגנטי: 20 מ"ל PBS עם 0.1% BSA ו-2 mM EDTA ועיקרו אותו בסינון. אחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: לא מומלץ לאחסן יותר מכמה ימים; יש לבדוק אם יש משקעים או זיהום לפני השימוש.
  2. פיפטה 500 μL של חרוזים מגנטיים IgG נגד ארנב לצינור מיקרוצנטריפוגה ולהוסיף 1 מ"ל של תמיסת ציפוי חרוזים מגנטית קרה כקרח.
  3. השתמש מפריד מגנטי כדי לשטוף את החרוזים.
  4. חזור על הכביסה 2x עם 1 מ"ל של תמיסת ציפוי חרוזים מגנטית קרה כקרח.
  5. להשהות מחדש את החרוזים ב 500 μL של תמיסת ציפוי חרוזים מגנטית ולעשות aliquots של 150 μL בצינורות microcentrifuge.
  6. יש להוסיף 15 מיקרוגרם של נוגדן LYVE-1 לכל צינורית (15 מיקרוליטר מריכוז מלאי נוגדנים של 1 מ"ג/מ"ל).
  7. יש לדגור למשך הלילה ב-4°C (75 °F) עם תסיסה מתמשכת.

4. טיהור תאי אנדותל לימפטיים

הערה: הכינו את החומרים והציוד הבאים: אינקובטור CO2 , שייקר, טיימר, פרפילם, DMEM, 1x תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית, BSA, PBS, תמיסת ציפוי חרוזים מגנטית, טריפסין-EDTA, לוחות תרבית רקמות בקוטר 100 מ"מ או 60 מ"מ, מסנני מזרקים 0.2 מיקרומטר, קולגן סוג I, חומצה אצטית, מדיום LEC.

  1. הכינו 50 מ"ל DMEM עם 1x תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית ו-0.1% BSA וסננו-עיקרו אותו.
  2. ציפוי 60 מ"מ צלחות תרבית רקמה עם 10 מיקרוגרם/מ"ל קולגן סוג I בחומצה אצטית 0.02 מ' למשך >20 דקות ב-37°C. יש לשטוף 2x עם PBS סטרילי.
  3. שטפו את החרוזים המצופים מראש עם 1 מ"ל של תמיסת ציפוי חרוזים מגנטית, באמצעות מפריד מגנטי.
  4. להשעות מחדש את החרוזים ב 150 μL של DMEM עם 0.1% BSA.
    הערה: כעת ניתן לאחסן את החרוזים בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש אחד.
  5. שטפו את התאים 2x עם PBS.
  6. הוסף 3 מ"ל DMEM עם 0.1% BSA (עבור צלחת תרבית רקמות 60 מ"מ) ו 50 μL של חרוזים מצומדים נוגדנים לתאים.
    הערה: אם התאים משני עכברים או יותר מאוגרים, השתמש בלוח תרבית רקמות 100 מ"מ והוסף 6 מ"ל DMEM עם 0.1% BSA.
  7. חותמים את המנה עם parafilm.
  8. מניחים את המנה על שייקר מתסיס ב-10 סל"ד ב-RT ודגרים על 10 דקות בדיוק.
    הערה: דגירה ארוכה יותר תגרום לכריכה לא ספציפית. כדי להבטיח שהחרוזים יתקשרו עם כל משטח הצלחת, סובבו ידנית את הצלחת לאחר כל כמה דקות כשהיא ממשיכה לרעוד.
  9. השליכו את המדיום ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS. בדוק במהירות את התאים כדי לאמת את נוכחותן של מושבות LEC על הצלחת.
  10. טריפסיניזציה של התאים: השתמש 1 מ"ל של טריפסין-EDTA לדגור במשך 3 דקות ב 37 ° C. בדוק את התאים עבור ניתוק מוצלח של התא.
  11. נטרל את התמיסה עם 2 מ"ל של מדיה LEC מלאה ולהעביר את התמיסה לצינור פוליפרופילן סטרילי 5 מ"ל.
  12. באמצעות מפריד מגנטי לשטוף תאים 4 x 3 מ"ל של DMEM עם 0.1% BSA כדי להסיר תאים לא קשורים.
  13. השהה מחדש את התאים הנותרים הקשורים לחרוזים במדיית LEC מלאה וצלחת על לוחות תרבית רקמה בקוטר 60 מ"מ שהיו מצופים קודם לכן בקולגן.
  14. לדגור על התאים ב 37 ° C ולשנות את המדיה כל יומיים לאחר שתי שטיפות PBS בכל פעם.
  15. תרבית את התאים עד שהם מגיעים למפגש (זה בדרך כלל לוקח 7 עד 10 ימים).
  16. בשלב זה, בדוק תאים מתחת למיקרוסקופ עבור מפגש ולהמשיך עם הכנת תאים עבור ציטומטריה זרימה. אם מזוהה אחוז F4/80+ גבוה, חזור על שלב הטיהור עם LYVE-1 (שלב 4: טיהור תאי אנדותל לימפה) שוב או באופן אידיאלי סמן לימפתי אחר (כלומר, פודופלנין14).
    הערה: הביטוי הגבוה של החלבון הממוקד על ידי הנוגדן באוכלוסיית התאים המטוהרים בחרוזים מגנטיים הוכח15,16. עם זאת, עבור LYVE-1, חשוב לבצע בקרת ציטומטריית זרימה לזיהוי אחוז תאי LYVE-1+ אחרים, בעיקר מקרופאגים. LYVE-1 מתבטא רק בתת-קבוצות של מקרופאגים הקשורים לגידולים ולפצעים, בעוד שבעור בריא, ביטוי LYVE-1 מוגבל יותר לתאי אנדותל לימפטיים17. לפיכך, בדיקת F4/80 אינה חובה, אלא תלויה בהקשר הניסויי. העכברים ששימשו להדגמה לא נשאו גידולים או פצעים, אלא רק דלקת פוטנציאלית כתוצאה מהסרת שיער, אך כללנו את צביעת F4/80 כבסיס לאחוז המקרופאגים LYVE-1+.

5. ציטומטריית זרימה

הערה: הכינו את החומרים והציוד הבאים: צנטריפוגה, אינקובטור CO2 , טיימר, המוציטומטר, תמיסת EDTA, 1x תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית, BSA, PBS, טריפסין-EDTA, צינורות פוליפרופילן, מסנני מזרק 0.2 מיקרומטר, 70% אתנול, נוגדן מצומד F4/80 FITC.

  1. הכינו PBS המכיל 0.1% BSA וסננו אותו.
  2. הכן תמיסת 1 mM EDTA ב- PBS.
  3. טריפסיניזציה של התאים: לדגור את התאים עם 1 מ"ל של 1 mM תמיסת EDTA במשך 5 דקות ב 37 ° C.
    הערה: דגירה עם תמיסת EDTA היא שיטה מתונה יותר של ניתוק תאים, אשר משמרת טוב יותר את החלבונים transmembrane והיא מועדפת, אבל זה דורש תקופות דגירה ארוכות יותר. לחלופין, ניתן להשתמש בתמיסת טריפסין-EDTA למשך דקירה של דקה אחת ב-37°C, אך הדבר יכול להשפיע על זיקת הנוגדנים עבור יישומי ציטומטריית זרימה.
  4. נטרל את התמיסה עם 2 מ"ל של מדיה LEC מלאה ולהעביר את התמיסה לצינור פוליפרופילן סטרילי 5 מ"ל.
  5. צנטריפוגה את הדגימות ב 250 × גרם במשך 5 דקות.
  6. יש לשטוף עם PBS.
  7. חזור על הצנטריפוגה ושטיפת PBS.
  8. השהה מחדש את התאים ב- PBS המכילים 0.1% BSA וספור אותם באמצעות המוציטומטר או שיטה חלופית. Aliquot ~ 1 × 106 תאים לתוך צינורות פוליפרופילן עם נפח סופי של 100 μl. משלב זה ואילך, בצע את כל השלבים ב 4 ° C.
    הערה: ניתן לתקן את התאים לפני צביעה או הכתמה בעודם בחיים. קיבוע יכול להיות suboptimal עבור cytometry זרימה, כמו נוגדנים מסוימים עשויים שלא לזהות את האנטיגנים לאחר קיבוע; לכן, אנו ממליצים להפעיל ציטומטריית זרימה מיד לאחר השלב הקודם ולדלג על שלב הקיבוע. אם הדבר אינו אפשרי, קיבוע לפני ניסוי ציטומטריית הזרימה יאפשר עיכוב בשלב ציטומטריית הזרימה. אם יש לבצע קיבוע, יש להעריך מראש את ביצועי הנוגדנים בהקשר של תאים קבועים.
  9. בצע קיבוע (שלב אופציונלי; אם אין לתקן את התאים, המשך עם immunostaining): להשהות מחדש את התאים באתנול 70% קר כקרח ולערבב בעדינות במשך 10 דקות על קרח.
    הערה: קיבוע אתנול יכול לחלחל לתאים ולהוביל לשחרור GFP; עם זאת, קיבוע מבוסס פרפורמלדהיד יכול להרוס צבעים המשמשים לציטומטריית זרימה ובאופן אידיאלי ניתן להימנע ממנו.
  10. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  11. לשטוף תאים 2x על ידי צנטריפוגה ב 250 × גרם במשך 5 דקות ב 1x PBS.
  12. המשך לשלב הבא או השעה מחדש את התאים ב 0.5-1 מ"ל של 1x PBS ולאחסן ב 4 ° C.

6. Immunostaining

הערה: טפל בתאים בעדינות והימנע מפיפטינג נרחב, במידת האפשר, כדי לשמור על שלמות קרום התא ולמזער את מוות התא, ולהבטיח שהתאים אינם יוצרים גושים. מתוך תאי האנדותל המבודדים, הכינו את הקבוצות הבאות: תאים לא מוכתמים ותאים מוכתמים עם סמן תאי אנדותל נוסף (כלומר, VEGFR3, פודופלנין), F4/80, ושניהם. כלול תאי אנדותל לימפהטיים של עכברים הזמינים באופן מסחרי ומקרופאגים, אם זמינים, כבקרות חיוביות. למטרות הדגמה, ובשל פלואורסצנטיות tdTomato אנדוגנית (PE+), השתמשנו בצביעת F4/80 מצומדת FITC.

  1. יש לדלל את הנוגדן הראשוני ב-PBS עם 0.1% BSA בהתאם לדילול המומלץ או הממוטב. הוסף 0.5 מיקרוגרם (1 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים) של נוגדן מצומד F4/80 FITC לתרחיף התא של 100 μLof .
  2. להשעות מחדש את התאים לאחר הוספת נוגדן פלואורסצנטי מצומד מדולל. מערבבים על ידי הבהוב צינור הפוליפרופילן כדי להבטיח שאין גושים וכל התאים מצופים כראוי.
  3. יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (תאים קבועים) או 30 דקות על קרח (תאים חיים) בחושך.
  4. שטפו תאים פי 2 על ידי צנטריפוגה שלהם ב 250 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C (עבור תאים חיים) או בטמפרטורת החדר (עבור תאים קבועים), באמצעות PBS עם 0.1% BSA בחושך.
  5. עבור נוגדנים מצומדים שאינם פלואורסצנטיים
    1. לדלל את הנוגדן המשני המצומד פלואורוכרום במאגר הדגירה. עבור נוגדנים מקמח Alexa, יש להשתמש בדילול של 1:500.
    2. הוסף את הנוגדן המשני ל -100 μL של תמיסת ההשעיה של התא.
    3. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (תאים קבועים) או על קרח (תאים חיים).
    4. יש לשטוף פעמיים באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורה של 250 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4°C (עבור תאים חיים) או בטמפרטורת החדר (עבור תאים קבועים) במאגר הדגירה.
  6. להשהות תאים ב 0.5 מ"ל של 1x PBS ולנתח אותם באמצעות ציטומטר זרימה.
  7. בצע את השלבים הבאים של אסטרטגיית gating כדי לזהות את אוכלוסיית המקרופאגים בתוך התאים המבטאים LYVE-1:
    1. חשבו על פיזור קדימה ועל הצד כדי להבחין באוכלוסיית התאים.
    2. שקול פיזור קדימה עבור גודל, שטח וגובה של תאים כדי להבחין בין התאים הבודדים (סינגלטים).
    3. קח בחשבון ביטוי F4/80 (FITC) וביטוי RFP (PE) כדי לזהות מקרופאגים (F4/80+) בתוך תאי מורין מבודדים המבטאים tdTomato (PE) (עקב נוכחותו של כתב tdTomato פלואורסצנטי בעכברים הספציפיים, המתוארים להלן).

תוצאות

השיטה פותחה כדי לזהות את ביטוי החלבון של GTPase קטן, RhoA, שהגן המקודד שלו נפל בשני האללים ונמחק תחת השפעת מקדם האנדותל הלימפתי המושרה בטמוקסיפן Prox1-CreERT2 18. ניתן לתרבית את ה- LECs המבודדים עד ארבעה דורות, ולאחר מכן הם הופכים למזדקנים. הם הוקפאו, הופשרו ועוררו בהצלחה עם אנגיופ?...

Discussion

מערכת הלימפה היא מווסת חשוב של התפקוד ההומיאוסטטי של הגוף, כאשר הפונקציות החשובות ביותר הן שמירה על פלזמה נוזלית, הסרת תוצרי לוואי של מטבוליזם תאי ומולקולות רעילות, ספיגת שומנים וסחר בתאי מערכת החיסון 1,19. זיהוי הסמנים המתאימים עורר פרץ של נתונים חדשים בתחו?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן ההלנית למחקר וחדשנות (00376), המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לסרטן (NCI) [מענק R15CA231339], המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס טק (TTUHSC) בית הספר לרוקחות משרד המדעים מענק (ל- C.M.M.), ועל ידי המכללה לרוקחות, אוניברסיטת לואיזיאנה מונרו מימון סטארט-אפ, המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) באמצעות המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים [מענק P20 GM103424-21] ותת-תוכנית התחרותיות במחקר (RCS) של מועצת העוצרים של לואיזיאנה באמצעות קרן התמיכה של מועצת העוצרים (LEQSF (2021-24)-RD-A-23) (ל- G.M). ציוד TTUHSC הנפוץ בשימוש הושג באמצעות מכון המחקר למניעת סרטן של טקסס (CPRIT) מענקים RP190524 ו RP200572. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, בהחלטה לכתוב או בהכנת כתב היד. התקציר הגרפי באיור 1A נוצר באמצעות BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm Syringe FiltersFisher Scientific09-719C
100 mm Tissue Culture DishesFisher ScientificFB012924
60 mm Tissue Culture DishesFisher ScientificFB012921
Animal Hair ClipperWahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100xFisher Scientific15240-062
Blunt ForcepsFine Science Tools11992-20
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA4919
Cell Strainer 40 μmFisher Scientific542040
Cell Strainer 70 μmFisher Scientific542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat TailCorning354249dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O
Collagenase Type IILife Technologies17101-015
DispaseLife Technologies17105-041
DMEMFisher Scientific11-995-073
DNAse I Solution (2,500 U/mL)Thermo Scientific90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle ConcentratorInvitrogen120-21D
EDTASigma-Aldrich3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium)R&D SystemsCCM027
Euthanasia chamberEuthanex Corporation
Fine ForcepsFine Science Tools11255-20
Fine Scissors-SharpFine Science Tools14060-10
FITC anti-mouse F4/80 AntibodyBiolegend123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic BeadsNew England BiolabsS1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction ChamberEuthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG BeadsThermo Scientific21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBSFisher ScientificAAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1ReliaTech GmbH103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene TubesCorning352063
Syringe Filters w 0.2 μm PoresFisher Scientific09-719C
Trypsin-EDTAFisher Scientific25-300-120

References

  1. Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. The lymphatic vasculature in the 21(st) century: novel functional roles in homeostasis and disease. Cell. 182 (2), 270-296 (2020).
  2. Liu, X., et al. Lymphoangiocrine signals promote cardiac growth and repair. Nature. 588 (7839), 705-711 (2020).
  3. Biswas, L., et al. Lymphatic vessels in bone support regeneration after injury. Cell. 186 (2), 382-397 (2023).
  4. Tammela, T., Alitalo, K. Lymphangiogenesis: molecular mechanisms and future promise. Cell. 140 (4), 460-476 (2010).
  5. Ji, R. C. The role of lymphangiogenesis in cardiovascular diseases and heart transplantation. Heart Failure Reviews. 27 (5), 1837-1856 (2022).
  6. Patnam, M., et al. Lymphangiogenesis guidance mechanisms and therapeutic implications in pathological states of the cornea. Cells. 12 (2), 319 (2023).
  7. Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52691 (2015).
  8. Jackson, D. G. Biology of the lymphatic marker LYVE-1 and applications in research into lymphatic trafficking and lymphangiogenesis. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 112 (7-8), 526-538 (2004).
  9. Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes and Development. 19 (3), 397-410 (2005).
  10. Wolters, G. H., Vos-Scheperkeuter, G. H., Lin, H. C., van Schilfgaarde, R. Different roles of class I and class II Clostridium histolyticum collagenase in rat pancreatic islet isolation. Diabetes. 44 (2), 227-233 (1995).
  11. Kubo, A., Aoki, S., Fujita, H. Whole-mount preparation and microscopic analysis of epidermis. Current Protocols. 2 (7), e464 (2022).
  12. Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
  13. Kazenwadel, J., Michael, M. Z., Harvey, N. L. Prox1 expression is negatively regulated by miR-181 in endothelial cells. Blood. 116 (13), 2395-2401 (2010).
  14. Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
  15. Choi, E. Y., et al. Del-1, an endogenous leukocyte-endothelial adhesion inhibitor, limits inflammatory cell recruitment. Science. 322 (5904), 1101-1104 (2008).
  16. Mikelis, C. M., et al. RhoA and ROCK mediate histamine-induced vascular leakage and anaphylactic shock. Nature Communications. 6, 6725 (2015).
  17. Schledzewski, K., et al. Lymphatic endothelium-specific hyaluronan receptor LYVE-1 is expressed by stabilin-1+, F4/80+, CD11b+ macrophages in malignant tumours and wound healing tissue in vivo and in bone marrow cultures in vitro: implications for the assessment of lymphangiogenesis. Journal of Pathology. 209 (1), 67-77 (2006).
  18. Akwii, R. G., et al. Angiopoietin-2-induced lymphatic endothelial cell migration drives lymphangiogenesis via the beta1 integrin-RhoA-formin axis. Angiogenesis. 25 (3), 373-396 (2022).
  19. Petrova, T. V., Koh, G. Y. Biological functions of lymphatic vessels. Science. 369 (6500), eaax4063 (2020).
  20. Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 453-458 (2003).
  21. Mellor, R. H., et al. Lymphatic dysfunction, not aplasia, underlies Milroy disease. Microcirculation. 17 (4), 281-296 (2010).
  22. Connell, F., Brice, G., Mortimer, P. Phenotypic characterization of primary lymphedema. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 140-146 (2008).
  23. Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. Journal of Pediatris. 164 (2), 383-388 (2014).
  24. Ji, Y., Chen, S., Peng, S., Xia, C., Li, L. Kaposiform lymphangiomatosis and kaposiform hemangioendothelioma: similarities and differences. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 165 (2019).
  25. Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. Journal of Experimental Medicine. 194 (6), 797-808 (2001).
  26. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  27. Garrafa, E., et al. Isolation, purification, and heterogeneity of human lymphatic endothelial cells from different tissues. Lymphology. 38 (4), 159-166 (2005).
  28. Kazenwadel, J., Secker, G. A., Betterman, K. L., Harvey, N. L. In vitro assays using primary embryonic mouse lymphatic endothelial cells uncover key roles for FGFR1 signalling in lymphangiogenesis. PLoS One. 7 (7), e40497 (2012).
  29. Steele, M. M., et al. T cell egress via lymphatic vessels is tuned by antigen encounter and limits tumor control. Nature Immunology. 24 (4), 664-675 (2023).
  30. Mammoto, T., et al. Effects of age-dependent changes in cell size on endothelial cell proliferation and senescence through YAP1. Aging. 11 (17), 7051-7069 (2019).
  31. Regina, C., et al. Vascular ageing and endothelial cell senescence: Molecular mechanisms of physiology and diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 159, 14-21 (2016).
  32. Muhleder, S., Fernandez-Chacon, M., Garcia-Gonzalez, I., Benedito, R. Endothelial sprouting, proliferation, or senescence: tipping the balance from physiology to pathology. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (4), 1329-1354 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

LYVE 1Cre loxEx Vivo In Vitro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved