Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

Summary

מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל מורין מנימי לימפה עוריים. תאי האנדותל הלימפטיים המבודדים יכולים לשמש לניסויים במבחנה במורד הזרם ולניתוח ביטוי חלבונים.

Abstract

מערכת הלימפה משתתפת בוויסות המעקב החיסוני, ספיגת שומנים ואיזון נוזלים ברקמות. הבידוד של תאי אנדותל לימפטיים מורין הוא תהליך חשוב למחקר הלימפה, שכן הוא מאפשר ביצוע ניסויים חוץ גופיים וביוכימיים על התאים המבודדים. יתר על כן, הפיתוח של טכנולוגיית Cre-lox איפשר מחסור ספציפי לרקמות של גנים שלא ניתן למקד באופן גלובלי, מה שהוביל לקביעה מדויקת של תפקידם ברקמות הנחקרות. דיסקציה של תפקידם של גנים מסוימים בפיזיולוגיה הלימפטית ובפתופיזיולוגיה דורשת שימוש במקדמים ספציפיים ללימפה, ולפיכך, אימות ניסיוני של רמות הביטוי של הגנים הממוקדים.

שיטות לבידוד יעיל של תאי אנדותל לימפטיים מעכברי בר או עכברים טרנסגניים מאפשרות שימוש בבדיקות ex vivo ו - in vitro כדי לחקור את המנגנונים המווסתים את תפקודי הלימפה ואת זיהוי רמות הביטוי של החלבונים הנחקרים. פיתחנו, תקננו והצגנו פרוטוקול לבידוד יעיל של תאי אנדותל לימפטיים עוריים (DLECs) באמצעות טיהור חרוזים מגנטי המבוסס על ביטוי LYVE-1. הפרוטוקול המתואר נועד לצייד את החוקרים בכלי להבנה נוספת ולהבהרה של שחקנים חשובים של תפקודי תאי אנדותל לימפה, במיוחד במתקנים שבהם ציוד מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות אינו זמין.

Introduction

מערכת הלימפה ממלאת תפקיד מרכזי בפיזיולוגיה האנושית. זה נחשב גורם הומיאוסטטי חיוני, המאפשר פונקציות חשובות, כגון שמירה על איזון נוזל רקמות-פלזמה, מעקב חיסוני, ספיגת שומנים¹, כמו גם פונקציות שזוהו לאחרונה, כגון יכולת התיקון של הלב² ואת יכולת התחדשות של עצם hematopoiesis³. למרות התפקיד המשמעותי של מערכת הלימפה, מספר היבטים של תפקיד הלימפה, כמו גם המנגנונים המולקולריים השולטים בפרמטרים פיזיולוגיים מסוימים ובתגובות נותרו חמקמקים. יתר על כן, פגמים בכלי הלימפה הם גורמים מפעילים או מתדרדרים במצבים פתופיזיולוגיים מסוימים. דוגמאות ידועות הן הלימפאדמה הראשונית והמשנית, בהתאם למקור הגנטי או הלא גנטי של המחלה,....

Protocol

מחקרים בבעלי חיים בוצעו על פי הפרוטוקולים המאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס טק (TTUHSC) עבור הניסויים ב- TTUHSC ועל ידי המנהל הווטרינרי של מחוז מערב יוון על פי הנחיה 2010/63 לניסויים באוניברסיטת פטרס. יש להקפיד על תקנות סילוק פסולת בעת השלכת חומרי פסולת בעלי חיים.

1. בידוד של דרמיס עכבר

1. יום 1
   הערה: ביום הראשון; הכינו את החומרים והציוד הבאים: תא הרדמה, קוצץ שיער לבעלי חיים, איזופלורן, מלקחיים עדינים, מסנני מזרק 0.2 מיקרומטר.
   1. הכינו תמיסת דיספז 2 מ"ג/מ"ל ב-DMEM עם 1x Antibiotic-Antimycotic Solution וסננו-עיקרו אותה.
      הערה: השימוש במדי....

תוצאות

השיטה פותחה כדי לזהות את ביטוי החלבון של GTPase קטן, RhoA, שהגן המקודד שלו נפל בשני האללים ונמחק תחת השפעת מקדם האנדותל הלימפתי המושרה בטמוקסיפן Prox1-CreER^{T2 18}. ניתן לתרבית את ה- LECs המבודדים עד ארבעה דורות, ולאחר מכן הם הופכים למזדקנים. הם הוקפאו, הופשרו ועוררו בהצלחה עם אנגיופ?.......

Discussion

מערכת הלימפה היא מווסת חשוב של התפקוד ההומיאוסטטי של הגוף, כאשר הפונקציות החשובות ביותר הן שמירה על פלזמה נוזלית, הסרת תוצרי לוואי של מטבוליזם תאי ומולקולות רעילות, ספיגת שומנים וסחר בתאי מערכת החיסון ^1,19. זיהוי הסמנים המתאימים עורר פרץ של נתונים חדשים בתחו?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Syringe Filters	Fisher Scientific	09-719C
100 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012924
60 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012921
Animal Hair Clipper	Wahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100x	Fisher Scientific	15240-062
Blunt Forceps	Fine Science Tools	11992-20
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4919
Cell Strainer 40 μm	Fisher Scientific	542040
Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat Tail	Corning	354249	dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O
Collagenase Type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM	Fisher Scientific	11-995-073
DNAse I Solution (2,500 U/mL)	Thermo Scientific	90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator	Invitrogen	120-21D
EDTA	Sigma-Aldrich	3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium)	R&D Systems	CCM027
Euthanasia chamber	Euthanex Corporation
Fine Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Fine Scissors-Sharp	Fine Science Tools	14060-10
FITC anti-mouse F4/80 Antibody	Biolegend	123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads	New England Biolabs	S1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber	Euthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads	Thermo Scientific	21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS	Fisher Scientific	AAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	SH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1	ReliaTech GmbH	103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene Tubes	Corning	352063
Syringe Filters w 0.2 μm Pores	Fisher Scientific	09-719C
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25-300-120