Выделение дермальных лимфатических эндотелиальных клеток мыши

Резюме

В данной работе описан метод выделения эндотелиальных клеток мышей из дермальных лимфатических капилляров с помощью магнитных шариков. Выделенные лимфатические эндотелиальные клетки могут быть использованы для последующих экспериментов in vitro и анализа экспрессии белков.

Аннотация

Лимфатическая система участвует в регуляции иммунного надзора, всасывания липидов и баланса тканевой жидкости. Выделение мышиных лимфатических эндотелиальных клеток является важным процессом для лимфатических исследований, поскольку позволяет проводить in vitro и биохимические эксперименты на выделенных клетках. Кроме того, развитие технологии Cre-lox позволило устранить тканеспецифический дефицит генов, которые не могут быть глобально нацелены, что привело к точному определению их роли в изучаемых тканях. Анализ роли тех или иных генов в лимфатической физиологии и патофизиологии требует использования лимфатических специфических промоторов и, таким образом, экспериментальной проверки уровней экспрессии генов-мишеней.

Методы эффективного выделения лимфатических эндотелиальных клеток от мышей дикого типа или трансгенных мышей позволяют использовать анализы ex vivo и in vitro для изучения механизмов регуляции лимфатических функций и идентификации уровней экспрессии изучаемых белков. Мы разработали, стандартизировали и представили протокол эффективного выделения мышиных дермальных лимфатических эндотелиальных клеток (DLECs) с помощью магнитной очистки шариками на основе экспрессии LYVE-1. Изложенный протокол направлен на то, чтобы вооружить исследователей инструментом для дальнейшего понимания и выяснения важных игроков функций эндотелиальных клеток лимфы, особенно в учреждениях, где отсутствует оборудование для сортировки клеток, активируемых флуоресценцией.

Введение

Лимфатическая система играет ключевую роль в физиологии человека. Он считается жизненно важным гомеостатическим фактором, который способствует важным функциям, таким как поддержание баланса тканевой и плазменной жидкости, иммунный надзор^и абсорбция липидов1, а также недавно выявленным функциям, таким как восстановительная^{способность сердца2} и регенеративная способность костей и кроветворения3^. Несмотря на значительную роль лимфатической системы, некоторые аспекты роли лимфатических систем, а также молекулярные механизмы, управляющие определенными физиологическими параметрами и реакциями, остаются ....

протокол

Исследования на животных проводились в соответствии с утвержденными протоколами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Центра медицинских наук Техасского технологического университета (TTUHSC) для экспериментов в TTUHSC и Ветеринарной администрацией префектуры Западной Греции в соответствии с Директивой 2010/63 для экспериментов в Университете Патр. Неукоснительно соблюдайте правила утилизации отходов при утилизации отходов жизнедеятельности животных.

1. Изоляция дермы мыши

1. День 1
   ПРИМЕЧАНИЕ: В день 1; Подготовьте следующие материалы и оборудование: анестезиологическую каме....

Результаты

Метод был разработан для идентификации экспрессии белка малой ГТФазы RhoA, кодирующий ген которой был флоксирован в обоих аллелях и удален под действием тамоксифен-индуцируемого лимфатического эндотелиально-специфического промотора Prox1-CreER^{T2 18}. Изолированные LEC м.......

Обсуждение

Лимфатическая система является важным регулятором гомеостатической функции организма, наиболее важными функциями которой являются поддержание жидкостной плазмы, удаление побочных продуктов клеточного метаболизма и токсичных молекул, абсорбция липидов и транспортировка иммунных к.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Syringe Filters	Fisher Scientific	09-719C
100 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012924
60 mm Tissue Culture Dishes	Fisher Scientific	FB012921
Animal Hair Clipper	Wahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100x	Fisher Scientific	15240-062
Blunt Forceps	Fine Science Tools	11992-20
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4919
Cell Strainer 40 μm	Fisher Scientific	542040
Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat Tail	Corning	354249	dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O
Collagenase Type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM	Fisher Scientific	11-995-073
DNAse I Solution (2,500 U/mL)	Thermo Scientific	90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator	Invitrogen	120-21D
EDTA	Sigma-Aldrich	3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium)	R&D Systems	CCM027
Euthanasia chamber	Euthanex Corporation
Fine Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Fine Scissors-Sharp	Fine Science Tools	14060-10
FITC anti-mouse F4/80 Antibody	Biolegend	123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads	New England Biolabs	S1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber	Euthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads	Thermo Scientific	21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS	Fisher Scientific	AAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	SH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1	ReliaTech GmbH	103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene Tubes	Corning	352063
Syringe Filters w 0.2 μm Pores	Fisher Scientific	09-719C
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25-300-120