Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
* Эти авторы внесли равный вклад
В данной работе описан метод выделения эндотелиальных клеток мышей из дермальных лимфатических капилляров с помощью магнитных шариков. Выделенные лимфатические эндотелиальные клетки могут быть использованы для последующих экспериментов in vitro и анализа экспрессии белков.
Лимфатическая система участвует в регуляции иммунного надзора, всасывания липидов и баланса тканевой жидкости. Выделение мышиных лимфатических эндотелиальных клеток является важным процессом для лимфатических исследований, поскольку позволяет проводить in vitro и биохимические эксперименты на выделенных клетках. Кроме того, развитие технологии Cre-lox позволило устранить тканеспецифический дефицит генов, которые не могут быть глобально нацелены, что привело к точному определению их роли в изучаемых тканях. Анализ роли тех или иных генов в лимфатической физиологии и патофизиологии требует использования лимфатических специфических промоторов и, таким образом, экспериментальной проверки уровней экспрессии генов-мишеней.
Методы эффективного выделения лимфатических эндотелиальных клеток от мышей дикого типа или трансгенных мышей позволяют использовать анализы ex vivo и in vitro для изучения механизмов регуляции лимфатических функций и идентификации уровней экспрессии изучаемых белков. Мы разработали, стандартизировали и представили протокол эффективного выделения мышиных дермальных лимфатических эндотелиальных клеток (DLECs) с помощью магнитной очистки шариками на основе экспрессии LYVE-1. Изложенный протокол направлен на то, чтобы вооружить исследователей инструментом для дальнейшего понимания и выяснения важных игроков функций эндотелиальных клеток лимфы, особенно в учреждениях, где отсутствует оборудование для сортировки клеток, активируемых флуоресценцией.
Лимфатическая система играет ключевую роль в физиологии человека. Он считается жизненно важным гомеостатическим фактором, который способствует важным функциям, таким как поддержание баланса тканевой и плазменной жидкости, иммунный надзори абсорбция липидов1, а также недавно выявленным функциям, таким как восстановительнаяспособность сердца2 и регенеративная способность костей и кроветворения3. Несмотря на значительную роль лимфатической системы, некоторые аспекты роли лимфатических систем, а также молекулярные механизмы, управляющие определенными физиологическими параметрами и реакциями, остаются ....
Исследования на животных проводились в соответствии с утвержденными протоколами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Центра медицинских наук Техасского технологического университета (TTUHSC) для экспериментов в TTUHSC и Ветеринарной администрацией префектуры Западной Греции в соответствии с Директивой 2010/63 для экспериментов в Университете Патр. Неукоснительно соблюдайте правила утилизации отходов при утилизации отходов жизнедеятельности животных.
1. Изоляция дермы мыши
Метод был разработан для идентификации экспрессии белка малой ГТФазы RhoA, кодирующий ген которой был флоксирован в обоих аллелях и удален под действием тамоксифен-индуцируемого лимфатического эндотелиально-специфического промотора Prox1-CreERT2 18. Изолированные LEC м.......
Лимфатическая система является важным регулятором гомеостатической функции организма, наиболее важными функциями которой являются поддержание жидкостной плазмы, удаление побочных продуктов клеточного метаболизма и токсичных молекул, абсорбция липидов и транспортировка иммунных к.......
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Эта работа была поддержана грантом Греческого фонда исследований и инноваций (00376), Национальными институтами здравоохранения, Национальным институтом рака (NCI) [грант R15CA231339], грантом Школы фармацевтических наук Центра медицинских наук Техасского технологического университета (TTUHSC) (для C.M.M.), а также стартовым финансированием Колледжа фармацевтики Университета Луизианы Монро. Национальные институты здравоохранения (NIH) через Национальный институт общих медицинских наук [Грант P20 GM103424-21] и Подпрограмма конкурентоспособности исследований (RCS) Совета регентов Луизианы через Фонд поддержки Совета регентов (LEQSF(2021-24)-RD-A-23) (в G.M.). Общее ис....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 μm Syringe Filters | Fisher Scientific | 09-719C | |
100 mm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
60 mm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | FB012921 | |
Animal Hair Clipper | Wahl | ||
Antibiotic-Antimycotic Solution 100x | Fisher Scientific | 15240-062 | |
Blunt Forceps | Fine Science Tools | 11992-20 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
Cell Strainer 40 μm | Fisher Scientific | 542040 | |
Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 542070 | |
CO2 Incubator | |||
Collagen I, High Concentration Rat Tail | Corning | 354249 | dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O |
Collagenase Type II | Life Technologies | 17101-015 | |
Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
DMEM | Fisher Scientific | 11-995-073 | |
DNAse I Solution (2,500 U/mL) | Thermo Scientific | 90083 | |
Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator | Invitrogen | 120-21D | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | |
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium) | R&D Systems | CCM027 | |
Euthanasia chamber | Euthanex Corporation | ||
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Fine Scissors-Sharp | Fine Science Tools | 14060-10 | |
FITC anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123107 | |
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads | New England Biolabs | S1432S | |
LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber | Euthanex Corporation | ||
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads | Thermo Scientific | 21356 | |
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1 | ReliaTech GmbH | 103-PA50 | |
Rotating/Shaking Incubator | |||
Round-Bottom Polypropylene Tubes | Corning | 352063 | |
Syringe Filters w 0.2 μm Pores | Fisher Scientific | 09-719C | |
Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25-300-120 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены