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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur magnetischen Bead-basierten Isolierung von murinen Endothelzellen aus dermalen lymphatischen Kapillaren beschrieben. Die isolierten lymphatischen Endothelzellen können für nachgelagerte In-vitro-Experimente und Proteinexpressionsanalysen verwendet werden.

Zusammenfassung

Das lymphatische System ist an der Regulierung der Immunüberwachung, der Lipidabsorption und des Flüssigkeitshaushalts des Gewebes beteiligt. Die Isolierung von murinen lymphatischen Endothelzellen ist ein wichtiger Prozess für die lymphatische Forschung, da sie die Durchführung von in vitro und biochemischen Experimenten an den isolierten Zellen ermöglicht. Darüber hinaus hat die Entwicklung der Cre-lox-Technologie den gewebespezifischen Mangel an Genen ermöglicht, die nicht global anvisiert werden können, was zur genauen Bestimmung ihrer Rolle in den untersuchten Geweben führt. Die Aufschlüsselung der Rolle bestimmter Gene in der lymphatischen Physiologie und Pathophysiologie erfordert die Verwendung von lymphatischen Promotoren und damit die experimentelle Überprüfung der Expressionsniveaus der Zielgene.

Methoden zur effizienten Isolierung von lymphatischen Endothelzellen aus Wildtyp- oder transgenen Mäusen ermöglichen den Einsatz von ex vivo und in vitro Assays, um die Mechanismen zu untersuchen, die die lymphatischen Funktionen regulieren, und die Identifizierung der Expressionsniveaus der untersuchten Proteine. Wir haben ein Protokoll für die effiziente Isolierung von murinen dermalen lymphatischen Endothelzellen (DLECs) mittels magnetischer Bead-Aufreinigung auf Basis der LYVE-1-Expression entwickelt, standardisiert und vorgestellt. Das skizzierte Protokoll zielt darauf ab, den Forschern ein Werkzeug an die Hand zu geben, um wichtige Akteure der lymphatischen Endothelzellfunktionen besser zu verstehen und aufzuklären, insbesondere in Einrichtungen, in denen keine fluoreszenzaktivierten Zellsortiergeräte zur Verfügung stehen.

Einleitung

Das Lymphsystem spielt eine zentrale Rolle in der menschlichen Physiologie. Es gilt als lebenswichtiger homöostatischer Faktor, der wichtige Funktionen wie die Aufrechterhaltung des Gleichgewichts zwischen Gewebe und Plasmaflüssigkeit, die Immunüberwachung und die Lipidabsorption1 sowie kürzlich identifizierte Funktionen wie die Reparaturfähigkeit des Herzens2 und die Regenerationsfähigkeit des Knochens und die Hämatopoese3 erleichtert. Trotz der bedeutenden Rolle des lymphatischen Systems bleiben mehrere Aspekte der Rolle der Lymphgefäße sowie die molekularen Mechanismen, die bestimmte physiologische Parameter und Reaktionen steuern, schwer fassbar. Darüber hinaus sind lymphatische Gefäßdefekte auslösende oder verschlechternde Faktoren bei bestimmten pathophysiologischen Zuständen. Bekannte Beispiele sind die primären und sekundären Lymphödeme, abhängig von der genetischen bzw. nicht-genetischen Ursache der Krankheit, während die Rolle des lymphatischen Systems für das Wachstum des Primärtumors und die Metastasierung von zentraler Bedeutung ist, da es als Kanal für die Metastasierung und als Modulator der Immunfunktionen fungieren kann1.

Die Verzögerung in der Erforschung und dem Wissen über das lymphatische System im Vergleich zu den Blutgefäßen ist hauptsächlich auf die spätere Entdeckung des lymphatischen Systems im Vergleich zum Blutgefäßsystem und die Verzögerung bei der Identifizierung lymphatischer spezifischer molekularer Marker zurückzuführen. Dies hat sich in den letzten Jahrzehnten stark verbessert, was zu einer Veränderung des herkömmlichen Bildes der Lymphgefäße im stationären Zustand und unter kranken Zuständen führte1. Ähnlich wie die Angiogenese ist die Lymphangiogenese die Bildung neuer Lymphgefäße aus bereits bestehenden und spielt eine zentrale Rolle bei der Entwicklung eines breiten Spektrums von Krankheiten 4,5,6. Im Gegensatz zur Angiogenese beschränkte sich die Untersuchung der Lymphangiogenese jedoch bisher auf meist in vivo Modelle, die sich auf die Entwicklung der Gefäßbildung und strukturelle Defekte in pathologischen Modellen konzentrierten. Die Isolierung der lymphatischen Endothelzellen ist wichtig für in vitro Studien, und dies kann durch das vorgestellte Protokoll gewährleistet werden.

Es wurden mehrere Protokolle für die lymphatische endotheliale Isolierung von Mäusen entwickelt, die den Einsatz von fluoreszenzaktivierter Zellsortierung erfordern7. Der Vorteil des Zellsortierers, sofern verfügbar, ist der höhere Reinheitsgrad im Gegensatz zur Bead-basierten Isolierung, wobei letztere eine höhere Ausbeute bietet. Das Protokoll nutzt die Expression des lymphatischen endothelialen Hyaluronan-Rezeptors 1 (LYVE-1), eines lymphatischen Endothelmarkers, der für den Zelltransport innerhalb der lymphatischen Gefäße wichtig ist 4,8. Da die Expression von LYVE-1 auf die lymphatischen Kapillaren und nicht auf die sammelnden Lymphgefäße beschränkt ist, eignet sich die Technik für die Isolierung von lymphatischen Endothelzellen spezifisch aus den lymphatischen Kapillaren, im Gegensatz zu anderen lymphatischen Markern wie Podoplanin, die in allen lymphatischen Endothelzellen einheitlich exprimiert werden9. Für das Protokoll wurden andere wichtige lymphatische Marker, die nicht transmembran waren, wie z. B. Prox1, ausgeschlossen.

Da das physiologische Ergebnis die Lymphangiogenese war, die normalerweise an den lymphatischen Kapillaren initiiert wird, wurde LYVE-1 aufgrund seiner Selektivität in diesen Zellen und der hohen Ausbeute des ausgewählten Antikörpers als Ziel ausgewählt. Bei den verwendeten Enzymen handelte es sich um Kollagenase Typ II, von der allgemein bekannt ist, dass sie bei der Kollagendissoziation wirksamer ist als Typ I10, und Dispase, eine breitere Protease, die regelmäßig für die Trennung von Dermis-Epidermis verwendet wird11; Es wurde jedoch auch über andere Enzyme für die Gewebetrennung berichtet12,13 und die verwendet werden können. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode zur Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen aus lymphatischen Kapillaren adulter Mäuse mit hoher Ausbeute unter Verwendung der magnetischen Bead-Reinigung zu beschreiben, insbesondere an Orten, an denen eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung nicht ohne weiteres verfügbar ist. Die Methode eignet sich für Anwendungen, bei denen die Reinheit der lymphatischen Endothelzellen für nachgelagerte Anwendungen beeinträchtigt werden kann.

Protokoll

Die Tierversuche wurden gemäß den genehmigten Protokollen des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Texas Tech University Health Sciences Center (TTUHSC) für die Versuche am TTUHSC und von der Veterinärverwaltung der Präfektur Westgriechenland gemäß der Richtlinie 2010/63 für die Versuche an der Universität Patras durchgeführt. Halten Sie sich bei der Entsorgung von tierischen Abfällen gewissenhaft an die Abfallentsorgungsvorschriften.

1. Isolierung der Mausdermis

  1. Tag 1
    HINWEIS: An Tag 1; Halten Sie folgende Materialien und Geräte bereit: Anästhesiekammer, Tierhaarschneider, Isofluran, feine Pinzette, 0,2 μm Spritzenfilter.
    1. Bereiten Sie eine 2 mg/ml Dispaselösung in DMEM mit 1x Antibiotisch-Antimykotischer Lösung vor und sterilisieren Sie sie.
      HINWEIS: Die Verwendung von Medium oder PBS kann durch HBSS ersetzt werden, da es in anderen berichteten Protokollen erfolgreich verwendet wurde12. Die 1x Antibiotikum-Antimykotische Lösung kann durch die Zugabe von Penicillin (100 I.E./ml), Streptomycin (100 μg/ml) und Amphotericin (2,5 μg/ml) substituiert werden.
    2. Betäuben Sie die Maus, indem Sie die Maus in eine Anästhesiekammer legen und mit Isofluran verabreichen (0,5-2% Isofluran, Durchfluss: 1 l/min). Wenn sich die Maus nicht mehr bewegt, bringen Sie sie aus dem Käfig und setzen Sie die Anästhesie fort, indem Sie einen Nasenkegel mit einem ähnlichen Isofluranfluss anpassen. Kneifen Sie das Tier in die Zehen, um ausreichende Anästhesiewerte zu bestätigen, und überwachen Sie die Maus ständig, um sicherzustellen, dass die tiefe Anästhesie erhalten bleibt (keine Motilität). Schneiden Sie ca. 9 cm2 des Rücken- und Bauchfells (Rücken bzw. Bauch der Maus) mit einem Haarschneider in Längsrichtung entlang der Mittellinie ab. Lassen Sie die Maus sich von der Narkose erholen und bringen Sie sie in den Käfig zurück.
      HINWEIS: Stattdessen kann eine Haarentfernungscreme (Enthaarungscreme) verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass das Fell in den zu isolierenden Hautbereichen vollständig entfernt wird, während die Unversehrtheit der Haut erhalten bleibt. Versuchen Sie, einen möglichst ausgedehnten Hautbereich abzuschneiden. Um sicherzustellen, dass mögliche Entzündungen durch die Haarentfernung behoben werden, muss die Zellisolierung am nächsten Tag erfolgen. Um die Anzahl der isolierten Zellen zu erhöhen, poolen Sie 2 bis 4 Mäuse pro Gruppe.
  2. Tag 2
    HINWEIS: Halten Sie folgende Materialien und Geräte bereit: Euthanasiekammer, Biosicherheitswerkbank, CO2 -Inkubator, Ethanol, feine Schere, feine Zange, stumpfe Pinzette, 100 mm Gewebekulturplatte, Dispase, DMEM, 1x Antibiotisch-Antimykotische Lösung.
    1. Euthanasieren Sie die Maus durch CO2 - Verabreichung und legen Sie sie in Rückenlage, wobei der abgeschnittene Bereich freigelegt wird. Sprühen Sie 70% Ethanol als Desinfektionsmittel.
      HINWEIS: Ab diesem Schritt müssen alle Schritte unter sterilen Bedingungen (in einer Biosicherheitswerkbank) durchgeführt werden.
    2. Legen Sie eine sterile 100 mm Gewebekulturplatte auf Eis.
    3. Machen Sie einen 0,5 Zoll großen oberflächlichen Schnitt am Bauch und schneiden Sie in Längsrichtung entlang der Mittellinie zum Hals und zum Unterbauch. Machen Sie seitliche Schnitte, um die Haut aufklappen zu können.
      HINWEIS: Die Schnittgröße und der isolierte Hautbereich hängen von der Mausgröße ab.
    4. Trennen Sie die Haut mit einer stumpfen Pinzette vorsichtig vom umgebenden Gewebe. Tun Sie dies, indem Sie den gesamten Rumpf der Maus umrunden und die Haut seitlich um den Hals und den Unterbauch schneiden.
    5. Legen Sie die Haut vorsichtig mit der Dermisseite nach unten in die 100-mm-Gewebekulturplatte und halten Sie die Haut so gedehnt wie möglich. Decken Sie die Teller ab und legen Sie sie auf Eis. Schließen Sie die Isolierung aller Mäuse aus der Gruppe ab.
    6. Nachdem die Haut von allen Mäusen extrahiert wurde, inkubieren Sie die Platten 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um das Explantat flach zu drücken.
    7. Geben Sie 6 ml Dispase-Lösung auf die Platte, achten Sie darauf, dass die Haut vollständig eingetaucht ist, und inkubieren Sie sie über Nacht bei leichtem Rühren bei 4 °C.
      HINWEIS: Anstelle von Dispase kann auch ein Trypsinverdau durchgeführt werden12, gefolgt von einer Liberase anstelle einer Kollagenase Typ II-Behandlung (unten).

2. Isolierung der Zellen aus der Dermis

  1. Tag 3
    HINWEIS: Halten Sie folgende Materialien und Geräte bereit: Zentrifuge, CO2 -Inkubator, Biosicherheitswerkstatt, Schere, DMEM, 1x Antibiotisch-Antimykotische Lösung, Kollagenase Typ II, PBS, konisches 50 mL Röhrchen, 100 mm und 60 mm Gewebekulturplatten, DNAse I Lösung, Kollagen Typ I, 70 μm und 40 μm Zellsiebe, 0,2 μm Spritzenfilter, LEC Medium.
    1. 500 mL 1x PBS (1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4, pH 7,4) vorbereiten und 20 min bei 15 psi autoklavieren oder mit Filter sterilisieren. Alternativ können Sie auch handelsübliches steriles PBS verwenden.
    2. Bereiten Sie 10 mL 2 mg/ml Kollagenase Typ II-Lösung in DMEM mit 1x Antibiotikum-Antimykotischer Lösung vor und sterilisieren Sie sie.
      HINWEIS: Führen Sie die nächsten Schritte unter einer sterilen Haube durch, um das Risiko einer Probenkontamination zu verringern.
    3. Verwenden Sie eine Pipette, um die Flüssigkeit aus der Schüssel zu entfernen.
    4. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Dermis (Unterseite der Haut) von der Epidermis (oben) zu trennen und sichtbares Fettgewebe zu entfernen. Übertragen Sie die Dermis auf eine saubere Gewebekulturplatte.
    5. Geben Sie 1 mL DMEM mit 1x Antibiotisch-Antimykotischer Lösung in die saubere Gewebekulturplatte und kippen Sie sie so, dass sich die Flüssigkeit auf einer Seite der Platte ansammelt.
    6. Die Dermis in 1-2 mm2 Stücke hacken und in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen umfüllen.
      HINWEIS: Dieser Schritt muss idealerweise innerhalb von 4-5 Minuten abgeschlossen sein, da eine längere Verarbeitung keine höhere Ausbeute oder ein höheres Überleben der Zellen zu erwarten hat.
    7. Fügen Sie 10 ml der Kollagenase Typ II-Lösung hinzu.
    8. Geben Sie 50 μl (25 Einheiten/ml der Lösung) DNAse I-Lösung hinzu (reduziert die Zellverklumpung) und verdauen Sie die Dermislösung 2 h lang bei 37 °C unter ständigem Rühren (verwenden Sie einen rotierenden/schüttelnden Inkubator bei 30-50 U/min).
      HINWEIS: Überprüfen Sie regelmäßig, ob der größte Teil der Dermis verdaut wurde. Ist dies nicht der Fall, erhöhen Sie die Aufschlusszeit (maximal 1 h extra) und die Rührgeschwindigkeit, wenn möglich.
    9. Beschichten Sie 60 mm Gewebekulturplatten mit 2 mL 10 μg/mL Kollagen Typ I in 0,02 m Essigsäure für >20 min bei 37 °C. 2x mit sterilem PBS waschen.
    10. Die Zellsuspension mit einem 70 μm Zellsieb filtrieren und 5 min bei 250 × g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand.
    11. In 10 mL DMEM mit 1x Antibiotisch-Antimykotischer Lösung resuspendieren.
    12. Die Zellsuspension mit einem 40 μm Zellsieb filtrieren und 5 min bei 250 × g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand.
    13. Resuspendieren Sie in 1 ml vollständigem LEC-Medium (Endothelial Cell Growth Base Medium with Supplement).
    14. Plattieren Sie die Zellen in der kollagenbeschichteten 60-mm-Gewebekulturplatte in vollständigen LEC-Medien. Dies wird Tag 0 der Zellkultur sein.
    15. Tauschen Sie das Medium alle 2 Tage aus, indem Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS waschen und frisches LEC-Medium hinzufügen.
    16. Wiederholen Sie Schritt 2.1.15, bis die Zellen zu 80-90 % konfluent sind.
      HINWEIS: Wenn die Aufreinigung durchgeführt wird, bevor die Zellen zu 80-90 % konfluiert sind, werden weniger lymphatische Endothelzellen isoliert. Dieser Vorgang dauert etwa 7 bis 10 Tage.

3. Magnetische Bead-Beschichtung mit LYVE-1-Antikörpern

HINWEIS: Halten Sie einen Tag vor dem Reinigungsschritt die folgenden Materialien und Geräte bereit: 4 °C Kühlschrank, Rotor, Magnetabscheider, PBS, Anti-Kaninchen-IgG-Magnetperlen, Mikrozentrifugenröhrchen, 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter, magnetische Bead-Beschichtungslösung, LYVE-1-Antikörper.

  1. Bereiten Sie die magnetische Bead-Beschichtungslösung vor: 20 mL PBS mit 0,1 % BSA und 2 mM EDTA und sterilisieren Sie sie. Bei 4 °C lagern.
    HINWEIS: Eine Lagerung von mehr als ein paar Tagen wird nicht empfohlen. Vor Gebrauch auf Ausfällungen oder Verunreinigungen prüfen.
  2. Pipettieren Sie 500 μl Anti-Kaninchen-IgG-Magnetkügelchen in ein Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 1 mL eiskalte magnetische Bead-Beschichtungslösung hinzu.
  3. Verwende einen Magnetabscheider, um die Perlen zu waschen.
  4. Wiederholen Sie die Waschgänge 2x mit 1 mL der eiskalten Magnetic Bead Coating Solution.
  5. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 500 μl magnetischer Bead-Beschichtungslösung und machen Sie Aliquote von 150 μl in Mikrozentrifugenröhrchen.
  6. Geben Sie 15 μg des LYVE-1-Antikörpers in jedes Röhrchen (15 μl aus einer Antikörperstammkonzentration von 1 mg/ml).
  7. Über Nacht bei 4 °C unter ständigem Rühren inkubieren.

4. Reinigung der lymphatischen Endothelzellen

HINWEIS: Halten Sie die folgenden Materialien und Geräte bereit: CO2 -Inkubator, Schüttler, Timer, Parafilm, DMEM, 1x Antibiotisch-Antimykotische Lösung, BSA, PBS, Magnetic Bead Coating Solution, Trypsin-EDTA, 100 mm oder 60 mm Gewebekulturplatten, 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter, Kollagen Typ I, Essigsäure, LEC-Medium.

  1. Bereiten Sie 50 mL DMEM mit 1x Antibiotikum-Antimykotischer Lösung und 0,1 % BSA vor und sterilisieren Sie es.
  2. Beschichten Sie 60 mm Gewebekulturplatten mit 10 μg/mL Kollagen Typ I in 0,02 m Essigsäure für >20 min bei 37 °C. 2x mit sterilem PBS waschen.
  3. Waschen Sie die vorbeschichteten Kügelchen mit 1 mL magnetischer Bead-Beschichtungslösung unter Verwendung eines Magnetabscheiders.
  4. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 150 μl DMEM mit 0,1 % BSA.
    HINWEIS: Die Perlen können nun bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.
  5. Waschen Sie die Zellen 2x mit PBS.
  6. Geben Sie 3 ml DMEM mit 0,1 % BSA (für eine 60-mm-Gewebekulturplatte) und 50 μl der Antikörper-konjugierten Kügelchen in die Zellen.
    HINWEIS: Wenn die Zellen von zwei oder mehr Mäusen gepoolt werden, verwenden Sie eine 100-mm-Gewebekulturplatte und fügen Sie 6 ml DMEM mit 0,1 % BSA hinzu.
  7. Verschließen Sie die Schale mit Parafilm.
  8. Stellen Sie die Schüssel auf einen Shaker, rühren Sie bei 10 U/min bei RT und inkubieren Sie sie genau 10 Minuten lang.
    HINWEIS: Eine längere Inkubation führt zu einer unspezifischen Bindung. Um sicherzustellen, dass die Perlen mit der gesamten Plattenoberfläche interagieren, drehen Sie die Platte alle paar Minuten manuell, während sie weiter wackelt.
  9. Entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Untersuchen Sie die Zellen schnell, um das Vorhandensein von LEC-Kolonien auf der Platte zu überprüfen.
  10. Trypsinisieren Sie die Zellen: Verwenden Sie 1 ml Trypsin-EDTA und inkubieren Sie es 3 Minuten lang bei 37 °C. Untersuchen Sie die Zellen auf eine erfolgreiche Zellablösung.
  11. Neutralisieren Sie die Lösung mit 2 mL vollständigem LEC-Medium und geben Sie die Lösung in ein steriles 5-ml-Polypropylenröhrchen.
  12. Mit einem Magnetabscheider werden 4 x 3 mL DMEM mit 0,1 % BSA gewaschen, um ungebundene Zellen zu entfernen.
  13. Resuspendieren Sie die verbleibenden bead-gebundenen Zellen in vollständigem LEC-Medium und -Platte auf die zuvor kollagenbeschichteten 60-mm-Gewebekulturplatten.
  14. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag nach jeweils zwei PBS-Wäschen.
  15. Kultivieren Sie die Zellen, bis sie die Konfluenz erreichen (normalerweise dauert es 7 bis 10 Tage).
  16. Zu diesem Zeitpunkt überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop auf Konfluenz und fahren Sie mit der Vorbereitung der Zellen für die Durchflusszytometrie fort. Wenn ein hoher F4/80+-Prozentsatz festgestellt wird, wiederholen Sie den Reinigungsschritt mit LYVE-1 (Schritt 4: Reinigung der lymphatischen Endothelzelle) erneut oder idealerweise mit einem anderen lymphatischen Marker (z. B. Podoplanin14).
    HINWEIS: Die hohe Expression des Proteins, auf das der Antikörper abzielt, in der magnetischen Bead-gereinigten Zellpopulation wurde nachgewiesen15,16. Für LYVE-1 ist es jedoch wichtig, eine Durchflusszytometrie-Kontrolle durchzuführen, um den Prozentsatz anderer LYVE-1+-Zellen, meist Makrophagen, zu identifizieren. LYVE-1 wird nur in Untergruppen von Makrophagen exprimiert, die mit Tumoren und Wunden assoziiert sind, während die Expression von LYVE-1 in gesunder Haut eher auf lymphatische Endothelzellen beschränkt ist17. Das F4/80-Screening ist also nicht verpflichtend, sondern abhängig vom experimentellen Kontext. Die Mäuse, die zur Demonstration verwendet wurden, trugen keine Tumore oder Wunden, sondern nur potenzielle Entzündungen durch Haarentfernung, aber wir schlossen die F4/80-Färbung als Ausgangswert für den Prozentsatz der LYVE-1+-Makrophagen ein.

5. Durchflusszytometrie

HINWEIS: Halten Sie die folgenden Materialien und Geräte bereit: Zentrifuge, CO2 -Inkubator, Timer, Hämozytometer, EDTA-Lösung, 1x Antibiotikum-Antimykotische Lösung, BSA, PBS, Trypsin-EDTA, Polypropylen-Röhrchen, 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter, 70% Ethanol, F4/80 FITC-konjugierter Antikörper.

  1. Bereiten Sie PBS mit 0,1 % BSA vor und sterilisieren Sie es.
  2. Bereiten Sie 1 mM EDTA-Lösung in PBS vor.
  3. Trypsinisieren Sie die Zellen: Inkubieren Sie die Zellen mit 1 mL 1 mM EDTA-Lösung für 5 min bei 37 °C.
    HINWEIS: Die Inkubation mit EDTA-Lösung ist eine mildere Methode der Zellablösung, bei der die Transmembranproteine besser erhalten bleiben und bevorzugt wird, aber längere Inkubationszeiten erforderlich sind. Alternativ kann Trypsin-EDTA-Lösung für eine 1-minütige Inkubation bei 37 °C verwendet werden, dies kann jedoch die Antikörperaffinität für Durchflusszytometrie-Anwendungen beeinträchtigen.
  4. Neutralisieren Sie die Lösung mit 2 mL vollständigem LEC-Medium und geben Sie die Lösung in ein steriles 5-ml-Polypropylenröhrchen.
  5. Die Proben werden bei 250 × g für 5 min zentrifugiert.
  6. Mit PBS waschen.
  7. Wiederholen Sie die Zentrifugation und die PBS-Wäsche.
  8. Resuspendieren Sie die Zellen in PBS, die 0,1 % BSA enthalten, und zählen Sie sie mit einem Hämozytometer oder einer alternativen Methode. Aliquot ~1 × 106 Zellen in Polypropylenröhrchen mit einem Endvolumen von 100 μl. Führen Sie ab diesem Schritt alle Schritte bei 4 °C aus.
    HINWEIS: Die Zellen können vor dem Färben oder bei lebendigem Leib fixiert werden. Die Fixierung kann für die Durchflusszytometrie suboptimal sein, da einige Antikörper die Antigene nach der Fixierung möglicherweise nicht nachweisen. Daher empfehlen wir, die Durchflusszytometrie unmittelbar nach dem vorherigen Schritt durchzuführen und den Fixationsschritt zu überspringen. Wenn dies nicht möglich ist, ermöglicht die Fixierung vor dem Durchflusszytometrie-Experiment eine Verzögerung des Durchflusszytometrie-Schritts. Soll eine Fixierung durchgeführt werden, sollte im Vorfeld die Leistungsfähigkeit der Antikörper im Kontext von fixierten Zellen evaluiert werden.
  9. Fixierung durchführen (optionaler Schritt; wenn die Zellen nicht fixiert werden sollen, mit der Immunfärbung fortfahren): Die Zellen in eiskaltem 70%igem Ethanol resuspendieren und 10 Minuten lang vorsichtig auf Eis mischen.
    HINWEIS: Die Ethanolfixierung kann die Zellen permeabilisieren und zur Freisetzung von GFP führen; Die Fixierung auf Paraformaldehyd-Basis kann jedoch Farbstoffe, die für die Durchflusszytometrie verwendet werden, zerstören und im Idealfall vermieden werden.
  10. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  11. Waschen Sie die Zellen 2x durch Zentrifugation bei 250 × g für 5 min in 1x PBS.
  12. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort oder resuspendieren Sie die Zellen in 0,5-1 ml 1x PBS und lagern Sie sie bei 4 °C.

6. Immunfärbung

HINWEIS: Gehen Sie vorsichtig mit den Zellen um und vermeiden Sie nach Möglichkeit umfangreiches Pipettieren, um die Integrität der Zellmembran zu erhalten und den Zelltod zu minimieren und sicherzustellen, dass die Zellen keine Klumpen bilden. Bereiten Sie aus den isolierten Endothelzellen die folgenden Gruppen vor: ungefärbte Zellen und gefärbte Zellen mit einem anderen Endothelzellmarker (d. h. VEGFR3, Podoplanin), F4/80 und beide. Im Handel erhältliche lymphatische Endothelzellen und Makrophagen der Maus, falls verfügbar, als Positivkontrollen einbeziehen. Zu Demonstrationszwecken und aufgrund der endogenen tdTomato-Fluoreszenz (PE+) haben wir die FITC-konjugierte F4/80-Färbung verwendet.

  1. Verdünnen Sie den Primärantikörper in PBS mit 0,1 % BSA gemäß der empfohlenen oder optimierten Verdünnung. 0,5 μg (1 μl Antikörperlösung) des F4/80 FITC-konjugierten Antikörpers zu den 100 μl der Zellsuspension hinzufügen.
  2. Resuspendieren Sie die Zellen nach Zugabe des verdünnten fluoreszierenden konjugierten Antikörpers. Mischen Sie, indem Sie das Polypropylenrohr schnippen, um sicherzustellen, dass keine Klumpen vorhanden sind und alle Zellen ordnungsgemäß beschichtet sind.
  3. Inkubieren Sie 1 h bei Raumtemperatur (feste Zellen) oder 30 min auf Eis (lebende Zellen) im Dunkeln.
  4. Waschen Sie die Zellen 2x, indem Sie sie bei 250 × g für 5 min bei 4 °C (für lebende Zellen) oder bei Raumtemperatur (für fixierte Zellen) zentrifugieren, wobei PBS mit 0,1 % BSA im Dunkeln verwendet wird.
  5. Für nicht-fluoreszierend konjugierte Antikörper
    1. Verdünnen Sie den Fluorochrom-konjugierten Sekundärantikörper im Inkubationspuffer. Verwenden Sie für Alexa Flour-Antikörper eine Verdünnung von 1:500.
    2. Geben Sie den Sekundärantikörper in 100 μl der Zellsuspensionslösung.
    3. 30 min bei Raumtemperatur (feste Zellen) oder auf Eis (lebende Zellen) inkubieren.
    4. Zweimal durch Zentrifugation bei 250 × g für 5 min bei 4 °C (für lebende Zellen) oder bei Raumtemperatur (für fixierte Zellen) im Inkubationspuffer waschen.
  6. Resuspendieren Sie Zellen in 0,5 mL 1x PBS und analysieren Sie sie mit einem Durchflusszytometer.
  7. Befolgen Sie diese Schritte der Gating-Strategie, um die Makrophagenpopulation innerhalb der LYVE-1-exprimierenden Zellen zu identifizieren:
    1. Berücksichtigen Sie die Vorwärts- und Seitenstreuung, um die Zellpopulation zu unterscheiden.
    2. Berücksichtigen Sie die Vorwärtsstreuung für Zellgröße, Fläche und Höhe, um die einzelnen Zellen (Singuletts) zu unterscheiden.
    3. Berücksichtigung der F4/80 (FITC)-Expression und der RFP (PE)-Expression zur Identifizierung von Makrophagen (F4/80+) innerhalb der tdTomato (PE)-exprimierenden isolierten Mauszellen (aufgrund des Vorhandenseins eines fluoreszierenden tdTomato-Reporters in den spezifischen Mäusen, siehe unten).

Ergebnisse

Die Methode wurde entwickelt, um die Proteinexpression einer kleinen GTPase, RhoA, zu identifizieren, deren kodierendes Gen in beiden Allelen gefloxt und unter der Wirkung des Tamoxifen-induzierbaren lymphatischen endothelspezifischen Promotors Prox1-CreERT2 18 deletiert wurde. Die isolierten LECs können bis zu vier Generationen lang kultiviert werden, danach werden sie seneszent. Sie wurden eingefroren, aufgetaut und erfolgreich mit Angiopoietin-2 stimuliert. Aufgrund der beg...

Diskussion

Das Lymphsystem ist ein wichtiger Regulator der homöostatischen Funktion des Körpers, wobei die wichtigsten Funktionen die Aufrechterhaltung des flüssigen Plasmas, die Entfernung von Nebenprodukten des Zellstoffwechsels und toxischen Molekülen, die Lipidabsorption und der Transport von Immunzellen sind 1,19. Die Identifizierung geeigneter Marker hat zu einer Flut neuer Daten auf dem Gebiet der Lymphgefäße geführt, die neue Funktionen der lymphatischen Gef?...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Hellenic Foundation for Research and Innovation (00376), den National Institutes of Health, dem National Cancer Institute (NCI) [Grant R15CA231339], dem Texas Tech University Health Sciences Center (TTUHSC) School of Pharmacy Office of the Sciences Grant (an C.M.M.) und durch die Anschubfinanzierung des College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe. die National Institutes of Health (NIH) über das National Institute of General Medical Science [Grant P20 GM103424-21] und das Research Competitiveness Subprogram (RCS) des Louisiana Board of Regents über den Board of Regents Support Fund (LEQSF(2021-24)-RD-A-23) (an G.M.). Die gängigen TTUHSC-Geräte wurden über die Grants RP190524 und RP200572 des Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) bezogen. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, bei der Entscheidung über das Verfassen oder bei der Erstellung des Manuskripts. Die grafische Zusammenfassung in Abbildung 1A wurde mit BioRender.com erstellt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm Syringe FiltersFisher Scientific09-719C
100 mm Tissue Culture DishesFisher ScientificFB012924
60 mm Tissue Culture DishesFisher ScientificFB012921
Animal Hair ClipperWahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100xFisher Scientific15240-062
Blunt ForcepsFine Science Tools11992-20
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA4919
Cell Strainer 40 μmFisher Scientific542040
Cell Strainer 70 μmFisher Scientific542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat TailCorning354249dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O
Collagenase Type IILife Technologies17101-015
DispaseLife Technologies17105-041
DMEMFisher Scientific11-995-073
DNAse I Solution (2,500 U/mL)Thermo Scientific90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle ConcentratorInvitrogen120-21D
EDTASigma-Aldrich3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium)R&D SystemsCCM027
Euthanasia chamberEuthanex Corporation
Fine ForcepsFine Science Tools11255-20
Fine Scissors-SharpFine Science Tools14060-10
FITC anti-mouse F4/80 AntibodyBiolegend123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic BeadsNew England BiolabsS1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction ChamberEuthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG BeadsThermo Scientific21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBSFisher ScientificAAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1ReliaTech GmbH103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene TubesCorning352063
Syringe Filters w 0.2 μm PoresFisher Scientific09-719C
Trypsin-EDTAFisher Scientific25-300-120

Referenzen

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