A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
التحليل الآلي الأمثل لتعديل توازن الميتوكوندريا العصبية الحية بواسطة مستقبلات حمض الريتينويك الخاصة بالنظائر
In This Article
Summary
شبكة الميتوكوندريا معقدة للغاية ، مما يجعل تحليلها صعبا للغاية. تقوم أداة MATLAB الجديدة بتحليل الميتوكوندريا الحية المصورة متحدة البؤر في صور الفاصل الزمني ولكنها تؤدي إلى حجم إخراج كبير يتطلب اهتماما يدويا فرديا. لمعالجة هذه المشكلة ، تم تطوير تحسين روتيني ، مما يسمح بتحليل سريع للملف.
Abstract
تجعل شبكة الميتوكوندريا المعقدة من الصعب للغاية تقسيم الخلايا الحية ومتابعتها وتحليلها. تسمح أدوات MATLAB بتحليل الميتوكوندريا في ملفات الفاصل الزمني ، مما يبسط ويسرع عملية معالجة الصور إلى حد كبير. ومع ذلك ، فإن الأدوات الحالية تنتج حجم إخراج كبير ، يتطلب اهتماما يدويا فرديا ، والإعدادات التجريبية الأساسية لها إخراج من آلاف الملفات ، كل منها يتطلب معالجة واسعة النطاق وتستغرق وقتا طويلا.
لمعالجة هذه المشكلات ، تم تطوير تحسين روتيني ، في كل من كود MATLAB ونماذج النص المباشر ، مما يسمح بتحليل سريع للملفات وتقليل قراءة المستندات ومعالجة البيانات بشكل كبير. بسرعة 100 ملف / دقيقة ، يسمح التحسين بإجراء تحليل سريع شامل. يحقق التحسين مخرجات النتائج عن طريق حساب متوسط البيانات الخاصة بالإطار للميتوكوندريا الفردية عبر الأطر الزمنية ، وتحليل البيانات بطريقة محددة ، بما يتفق مع تلك المخرجات من الأدوات الحالية. تم إجراء التصوير الحي متحد البؤر باستخدام صبغة رباعي ميثيل رودامين إستر الميثيل ، وتم التحقق من صحة التحسين الروتيني من خلال علاج الخلايا العصبية بمنبهات مستقبلات حمض الريتينويك (RAR) ، والتي تم تحديد آثارها على الميتوكوندريا العصبية في الأدبيات. كانت النتائج متسقة مع الأدبيات وسمحت بمزيد من التوصيف لسلوك شبكة الميتوكوندريا استجابة لتعديل RAR الخاص بالنظائر.
سمحت هذه المنهجية الجديدة بالتوصيف السريع والتحقق من صحة شبكة الميتوكوندريا العصبية الكاملة ، ولكنها تسمح أيضا بالتمايز بين الميتوكوندريا المحورية وجسم الخلية ، وهي ميزة أساسية يجب تطبيقها في مجال علم الأعصاب. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول على التجارب التي تستخدم علاجات سريعة المفعول ، مما يسمح بتصوير نفس الخلايا قبل وبعد العلاج ، متجاوزا مجال علم الأعصاب.
Introduction
تقع الميتوكوندريا الخلوية في مركز جميع الحالات الفسيولوجية ، والفهم الشامل لتوازنها (الميتوستاسيس) وسلوكها أمر بالغ الأهمية للمساعدة في تحديد العلاج الدوائي لمجموعة واسعة من الأمراض ، بما في ذلك السرطان ومرض الزهايمر 1,2.
تلعب الميتوكوندريا أدوارا خلوية حاسمة في توازن الطاقة ، وتوليد ATP ، وتخزين الكالسيوم المؤقت ، وتنظيم أنواع الأكسجين التفاعلية ، والميتوكستاس ضروري للحفاظ على توازن البروتين لأن المرافقين الجزيئيين يعتمدون على الطاقة3. ويتطلب ذلك تعديلا ثابتا وديناميا للشبكة وتكيفا لتلبية الاحتياجات الخلوية بكفاءة، وينظم نقل الميتوكوندريا مسارات إشارات مختلف....
Protocol
ملاحظة: يحتوي هذا البروتوكول على خطوتين رئيسيتين: خطوة معملية رطبة ، تتضمن زراعة الخلايا والفحص المجهري الحي متحد البؤر للحصول على صور للميتوكوندريا الحية (الشكل 1) وخطوة في السيليكو لتحليل الصور التي تم الحصول عليها (الشكل 2). لتحليل البيانات الآلي للميتوكوندريا الحية ثلاثية الأبعاد ، تم استخدام مقياس Mitometer لتطبيق MATLAB على النحو المقدم من Lefebvre et al.9. التحسين الروتيني مكتوب في MATLAB. يتوفر البرنامج والإصدارات المحدثة ومعالجة وحدات ماكرو ImageJ مجانا عبر الإنترنت من خلال GitHub ، في https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB.
النتائج
لتعزيز وتسريع تحليل ملفات الإخراج بتنسيق .txt ، تم ترميز تحسين روتيني يقرأ البيانات المتوافقة مع Mitometer .txt ملفات الإخراج ، مع أعمدة تمثل إطارا وخطوطا تمثل الميتوكوندريا المحددة. ينتج التحسين الروتيني بيانات بقيمة واحدة لكل معلمة عن طريق حساب متوسط الإطارات لكل ميتوكوندريا محددة ثم حساب متو?.......
Discussion
ينتج التصوير الخلوي الحي ملفات كبيرة تتطلب معالجة حوسبة جادة ، ولكن حتى أحدث الأدوات تتطلب إدخالا يدويا مكثفا للمعالجة. يركز هذا التحسين الروتيني على تبسيط عملية تحليل الميتوكوندريا على مقياس الانقسام لأن هذه الأداة تقدم توازنا جيدا جدا بين مدخلات المستخدم وإخراج البيانات. تمت مراجعة مق.......
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
Acknowledgements
تم إجراء الحصول على الصور في منشأة LiM الخاصة ب iBiMED ، وهي عقدة PPBI (المنصة البرتغالية للتصوير الحيوي): POCI-01-0145-FEDER-022122. تم دعم هذا العمل من قبل FCT (EXPL / BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276) ، وهي منحة إلى DT من Fundação para a Ciência e Tecnologia of Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND) ، منحة من ATG-The Gabba Alumni Association إلى نائب الرئيس ، ومعهد الطب الحيوي-iBiMED ، جامعة أفيرو.
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
References
- Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and cancer.
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved