Оптимизированный автоматизированный анализ модуляции гомеостаза митохондрий живых нейронов изоформ-специфическими рецепторами ретиноевой кислоты

Резюме

Митохондриальная сеть чрезвычайно сложна, что делает ее очень сложной для анализа. Новый инструмент MATLAB анализирует митохондрии с конфокальными изображениями в реальном времени на таймлапс-изображениях, но приводит к большому объему вывода, требующему индивидуального ручного вмешательства. Для решения этой проблемы была разработана рутинная оптимизация, позволяющая быстро анализировать файлы.

Аннотация

Сложная митохондриальная сеть делает очень сложной сегментацию, отслеживание и анализ живых клеток. Инструменты MATLAB позволяют анализировать митохондрии в таймлапс-файлах, значительно упрощая и ускоряя процесс обработки изображений. Тем не менее, существующие инструменты выдают большой объем выходных данных, требующий индивидуального ручного вмешательства, а базовые экспериментальные установки позволяют выводить тысячи файлов, каждый из которых требует длительной и трудоемкой обработки.

Для решения этих проблем была разработана рутинная оптимизация, как в коде MATLAB, так и в формах live-script, что позволило ускорить анализ файлов и значительно сократить чтение документов и обработку данных. Со скоростью 100 файлов/мин оптимизация позволяет проводить общий быстрый анализ. Оптимизация позволяет получить результаты путем усреднения данных, специфичных для отдельных митохондрий, за все периоды времени, анализируя данные определенным образом, в соответствии с результатами, полученными существующими инструментами. Конфокальную визуализацию в реальном времени проводили с использованием метилового эфира красителя тетраметилродамина, а рутинная оптимизация была подтверждена путем обработки нейрональных клеток агонистами рецепторов ретиноевой кислоты (RAR), влияние которых на митохондрии нейронов установлено в литературе. Полученные результаты согласовывались с литературными данными и позволили в дальнейшем охарактеризовать поведение митохондриальной сети в ответ на изоформ-специфическую модуляцию RAR.

Эта новая методология позволила быстро и достоверно охарактеризовать сеть митохондрий целых нейронов, а также дифференцировать митохондрии аксонов и митохондрий клеточного тела, что является важной функцией для применения в области нейробиологии. Более того, этот протокол может быть применен к экспериментам с использованием быстродействующих методов лечения, позволяя визуализировать одни и те же клетки до и после лечения, выходя за рамки области неврологии.

Введение

Клеточные митохондрии находятся в центре всех физиологических состояний, и глубокое понимание их гомеостаза (митостаза) и поведения имеет первостепенное значение для помощи в определении фармакологического лечения широкого спектра заболеваний, включая рак^{и болезнь Альцгеймера.}

Митохондрии играют важнейшую клеточную роль в энергетическом гомеостазе, выработке АТФ, буферизации кальция и регуляции АФК, а митостаз необходим для поддержания белкового гомеостаза, поскольку молекулярные шапероны^{энергетически} зависимы. Они требуют постоянной и динамической модуляции ....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол состоит из двух основных этапов: этап мокрой лаборатории, включающий культуру клеток и живую конфокальную микроскопию для получения изображений живых митохондрий (рис. 1), и этап in silico для анализа полученных изображений (рис. 2). Для автоматизированного анализа данных митохондрий с 3D-изображениями в реальном времени использовалось приложение MATLAB Mitometer, предоставленное Lefebvre et ^al.9. Рутинная оптимизация написана на MATLAB. Программное обеспечение, обновленные версии и обработка макросов ImageJ находятся в свободном доступе онлайн на Git....

Результаты

Чтобы улучшить и ускорить анализ выходных файлов в .txt формате, была закодирована рутинная оптимизация, которая считывает данные в соответствии с выходными файлами Mitometer .txt, со столбцами, представляющими рамку, и линиями, представляющими идентифицированные митохондрии. Рутинная оптими.......

Обсуждение

Визуализация живых клеток позволяет создавать большие файлы, которые требуют серьезной вычислительной обработки, но даже самые современные инструменты требуют большого количества ручного ввода для обработки. Эта рутинная оптимизация направлена на упрощение процесса анализа митохо?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AM580	Sigma-Aldrich	A8843
BDNF	Thermo-Fisher	RP8642
BMS493	Tocris Bioscience	3409
CD2314	Tocris Bioscience	3824
Ch55	Tocris Bioscience	2020
Foetal Bovine Serum	Thermo-Fisher	10270106
GraphPad Prism v4.0	GraphPad Software, La Jolla	n/a
Ham’s F12 Nutrient Mix	Thermo-Fisher	21765029
MATLAB R2022a	MathWorks	n/a
Minimal Essential Medium	Thermo-Fisher	31095
Nunc Glass Bottom Dishes	Thermo-Fisher	150680
Phosphate Buffer Saline Solution	Thermo-Fisher	28372
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
TMRM	Thermo-Fisher	T668
Zeiss LSM 510	Carl Zeiss	n/a	Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective