Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Митохондриальная сеть чрезвычайно сложна, что делает ее очень сложной для анализа. Новый инструмент MATLAB анализирует митохондрии с конфокальными изображениями в реальном времени на таймлапс-изображениях, но приводит к большому объему вывода, требующему индивидуального ручного вмешательства. Для решения этой проблемы была разработана рутинная оптимизация, позволяющая быстро анализировать файлы.

Аннотация

Сложная митохондриальная сеть делает очень сложной сегментацию, отслеживание и анализ живых клеток. Инструменты MATLAB позволяют анализировать митохондрии в таймлапс-файлах, значительно упрощая и ускоряя процесс обработки изображений. Тем не менее, существующие инструменты выдают большой объем выходных данных, требующий индивидуального ручного вмешательства, а базовые экспериментальные установки позволяют выводить тысячи файлов, каждый из которых требует длительной и трудоемкой обработки.

Для решения этих проблем была разработана рутинная оптимизация, как в коде MATLAB, так и в формах live-script, что позволило ускорить анализ файлов и значительно сократить чтение документов и обработку данных. Со скоростью 100 файлов/мин оптимизация позволяет проводить общий быстрый анализ. Оптимизация позволяет получить результаты путем усреднения данных, специфичных для отдельных митохондрий, за все периоды времени, анализируя данные определенным образом, в соответствии с результатами, полученными существующими инструментами. Конфокальную визуализацию в реальном времени проводили с использованием метилового эфира красителя тетраметилродамина, а рутинная оптимизация была подтверждена путем обработки нейрональных клеток агонистами рецепторов ретиноевой кислоты (RAR), влияние которых на митохондрии нейронов установлено в литературе. Полученные результаты согласовывались с литературными данными и позволили в дальнейшем охарактеризовать поведение митохондриальной сети в ответ на изоформ-специфическую модуляцию RAR.

Эта новая методология позволила быстро и достоверно охарактеризовать сеть митохондрий целых нейронов, а также дифференцировать митохондрии аксонов и митохондрий клеточного тела, что является важной функцией для применения в области нейробиологии. Более того, этот протокол может быть применен к экспериментам с использованием быстродействующих методов лечения, позволяя визуализировать одни и те же клетки до и после лечения, выходя за рамки области неврологии.

Введение

Клеточные митохондрии находятся в центре всех физиологических состояний, и глубокое понимание их гомеостаза (митостаза) и поведения имеет первостепенное значение для помощи в определении фармакологического лечения широкого спектра заболеваний, включая раки болезнь Альцгеймера.

Митохондрии играют важнейшую клеточную роль в энергетическом гомеостазе, выработке АТФ, буферизации кальция и регуляции АФК, а митостаз необходим для поддержания белкового гомеостаза, поскольку молекулярные шапероныэнергетически зависимы. Они требуют постоянной и динамической модуляции ....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол состоит из двух основных этапов: этап мокрой лаборатории, включающий культуру клеток и живую конфокальную микроскопию для получения изображений живых митохондрий (рис. 1), и этап in silico для анализа полученных изображений (рис. 2). Для автоматизированного анализа данных митохондрий с 3D-изображениями в реальном времени использовалось приложение MATLAB Mitometer, предоставленное Lefebvre et al.9. Рутинная оптимизация написана на MATLAB. Программное обеспечение, обновленные версии и обработка макросов ImageJ находятся в свободном доступе онлайн на Git....

Результаты

Чтобы улучшить и ускорить анализ выходных файлов в .txt формате, была закодирована рутинная оптимизация, которая считывает данные в соответствии с выходными файлами Mitometer .txt, со столбцами, представляющими рамку, и линиями, представляющими идентифицированные митохондрии. Рутинная оптими.......

Обсуждение

Визуализация живых клеток позволяет создавать большие файлы, которые требуют серьезной вычислительной обработки, но даже самые современные инструменты требуют большого количества ручного ввода для обработки. Эта рутинная оптимизация направлена на упрощение процесса анализа митохо?.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.

Благодарности

Получение изображений было выполнено на объекте LiM iBiMED, узле PPBI (Португальская платформа биовизуализации): POCI-01-0145-FEDER-022122. Эта работа была поддержана FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276), грантом DT от Fundação para a Ciência e Tecnologia Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), грантом ATG-The Gabba Alumni Association для вице-президента и Институтом биомедицины iBiMED, Университет Авейру.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AM580Sigma-AldrichA8843
BDNF Thermo-FisherRP8642
BMS493Tocris Bioscience 3409
CD2314Tocris Bioscience3824
Ch55Tocris Bioscience 2020
Foetal Bovine SerumThermo-Fisher10270106
GraphPad Prism v4.0GraphPad Software, La Jollan/a
Ham’s F12 Nutrient MixThermo-Fisher21765029
MATLAB R2022a MathWorksn/a
Minimal Essential MediumThermo-Fisher31095
Nunc Glass Bottom DishesThermo-Fisher150680
Phosphate Buffer Saline SolutionThermo-Fisher28372
Retinoic acidSigma-Aldrich R2625
TMRM Thermo-FisherT668
Zeiss LSM 510Carl Zeissn/aEquiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective 

Ссылки

  1. Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
  2. Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and cancer.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

197MATLABMATLAB

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены