동형 특이적 레티노산 수용체에 의한 살아있는 신경 미토콘드리아 항상성 조절의 최적화된 자동 분석

요약

미토콘드리아 네트워크는 매우 복잡하여 분석하기가 매우 어렵습니다. 새로운 MATLAB 툴은 타임랩스 이미지에서 실시간 컨포칼 이미징 미토콘드리아를 분석하지만, 출력 볼륨이 커서 개별 수동 주의가 필요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 신속한 파일 분석이 가능한 루틴 최적화가 개발되었습니다.

초록

복잡한 미토콘드리아 네트워크는 살아있는 세포를 분할, 추적 및 분석하는 것을 매우 어렵게 만듭니다. MATLAB 툴을 사용하면 타임랩스 파일의 미토콘드리아를 분석할 수 있어 이미지 처리 프로세스가 상당히 간소화되고 속도가 빨라집니다. 그럼에도 불구하고 기존 도구는 많은 양의 출력을 생성하므로 개별적인 수동 주의가 필요하며, 기본 실험 설정에는 수천 개의 파일이 출력되어 각각 광범위하고 시간이 많이 소요되는 처리가 필요합니다.

이러한 문제를 해결하기 위해 MATLAB 코드 및 라이브 스크립트 형식 모두에서 루틴 최적화가 개발되어 신속한 파일 분석이 가능하고 문서 읽기 및 데이터 처리가 크게 줄었습니다. 100개 파일/분의 속도로 최적화를 통해 전반적으로 빠른 분석이 가능합니다. 최적화는 시간 프레임 전반에 걸쳐 개별 미토콘드리아에 대한 프레임별 데이터의 평균을 구하고 기존 도구의 출력과 일치하는 정의된 방식으로 데이터를 분석하여 결과 출력을 달성합니다. 염료 테트라메틸로다민 메틸 에스테르를 사용하여 실시간 공초점 이미징을 수행했으며, 신경 세포 미토콘드리아에 대한 효과가 문헌에 확립된 레티노산 수용체(RAR) 작용제로 신경 세포를 처리하여 일상적인 최적화를 검증했습니다. 결과는 문헌과 일치했으며 동형 특이적 RAR 변조에 대한 반응으로 미토콘드리아 네트워크 행동의 추가 특성화를 허용했습니다.

이 새로운 방법론은 전체 뉴런 미토콘드리아 네트워크의 빠르고 검증된 특성 분석을 가능하게 할 뿐만 아니라 신경과학 분야에 적용하기 위한 필수 기능인 축삭돌기와 세포체 미토콘드리아를 구별할 수 있게 해줍니다. 또한, 이 프로토콜은 속효성 치료법을 사용하는 실험에 적용할 수 있어 치료 전후에 동일한 세포를 이미징할 수 있어 신경 과학 분야를 초월합니다.

서문

세포 미토콘드리아는 모든 생리적 상태의 중심에 있으며, 세포 미토콘드리아의 항상성(유사분열)과 행동에 대한 철저한 이해는 암 및 알츠하이머병을 포함한 광범위한 질병에 대한 약리학적 치료법을 식별하는 데 가장 중요합니다 ^1,2.

미토콘드리아는 에너지 항상성, ATP 생성, 칼슘 완충 및 ROS 조절에 중요한 세포 역할을 하며, 분자 샤페론은 에너지 의존적이기 때문에 단백질 항상성을 유지하는 데 유사분열은 필수적입니다³. 이를 위해서는 세포의 요구를 효율적으로 충족하기 위해 지속적이고 역동적인 네트워크 변조 및 적응이 필요하며, 미토콘드리아 수송은 다양한 신호 경로에 의해 조절됩니다. 이전 연구에서는 이러한 경로 중 하나인 레티노산 수용체(^RAR)4,5에 대해 설명했습니다. 레티노산(RA)은 RAR 활성화를 통해 축삭돌기 및 신경돌기 성장을 촉진합니다. 생쥐의 일차 피질 뉴런에서 RAR-β의 활성화는 신경돌기의 미토콘드리아 성장, 속도 및 이동성을 촉진한다⁶

프로토콜

참고: 이 프로토콜에는 살아있는 미토콘드리아의 이미지를 얻기 위해 세포 배양 및 살아있는 공초점 현미경을 사용하는 습식 실험실 단계(그림 1)와 얻은 이미지를 분석하기 위한 인실리코 단계(그림 2)의 두 가지 주요 단계가 있습니다. 3D 실시간 이미징 미토콘드리아의 자동화된 데이터 분석을 위해 Lefebvre et ^al.9에서 제공한 MATLAB 응용 프로그램 Mitometer를 사용했습니다. 루틴 최적화는 MATLAB으로 작성되었습니다. 소프트웨어, 업데이트된 버전 및 처리 ImageJ 매크로는 GitHub(https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB)를 통해 온라인으로 무료로 사용할 수 있습니다.

1. 살아있는 현미경 검사

토론

라이브 셀 이미징은 고도의 컴퓨팅 처리가 필요한 대용량 파일을 생성하지만, 최신 도구조차도 처리하려면 광범위한 수동 입력이 필요합니다. 이 루틴 최적화는 Mitometer에서 미토콘드리아 분석 프로세스를 단순화하는 데 중점을 두는데, 이 도구는 사용자 입력과 데이터 출력 간에 매우 좋은 균형을 제공하기 때문입니다. 미토콘드리아 이미지 분석을 위한 다양한 도구 간의 포괄적인 비교는 이전?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AM580	Sigma-Aldrich	A8843
BDNF	Thermo-Fisher	RP8642
BMS493	Tocris Bioscience	3409
CD2314	Tocris Bioscience	3824
Ch55	Tocris Bioscience	2020
Foetal Bovine Serum	Thermo-Fisher	10270106
GraphPad Prism v4.0	GraphPad Software, La Jolla	n/a
Ham’s F12 Nutrient Mix	Thermo-Fisher	21765029
MATLAB R2022a	MathWorks	n/a
Minimal Essential Medium	Thermo-Fisher	31095
Nunc Glass Bottom Dishes	Thermo-Fisher	150680
Phosphate Buffer Saline Solution	Thermo-Fisher	28372
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
TMRM	Thermo-Fisher	T668
Zeiss LSM 510	Carl Zeiss	n/a	Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective