Analisi automatizzata ottimizzata della modulazione dell'omeostasi dei mitocondri neuronali vivi da parte dei recettori dell'acido retinoico isoform-specifici

Riepilogo

La rete mitocondriale è estremamente complessa, il che la rende molto difficile da analizzare. Un nuovo strumento MATLAB analizza i mitocondri confocali in tempo reale nelle immagini timelapse, ma produce un grande volume di output che richiede un'attenzione manuale individuale. Per risolvere questo problema, è stata sviluppata un'ottimizzazione di routine, che consente una rapida analisi dei file.

Abstract

La complessa rete mitocondriale rende molto difficile segmentare, seguire e analizzare le cellule vive. Gli strumenti MATLAB consentono l'analisi dei mitocondri in file timelapse, semplificando e velocizzando notevolmente il processo di elaborazione delle immagini. Ciononostante, gli strumenti esistenti producono un grande volume di output, che richiede un'attenzione manuale individuale, e le configurazioni sperimentali di base hanno un output di migliaia di file, ognuno dei quali richiede una gestione estesa e dispendiosa in termini di tempo.

Per risolvere questi problemi, è stata sviluppata un'ottimizzazione di routine, sia in codice MATLAB che in forma live-script, che consente una rapida analisi dei file e riduce significativamente la lettura e l'elaborazione dei dati. Con una velocità di 100 file/min, l'ottimizzazione consente un'analisi complessivamente rapida. L'ottimizzazione raggiunge l'output dei risultati calcolando la media dei dati specifici del frame per i singoli mitocondri in intervalli di tempo, analizzando i dati in modo definito, coerente con quelli degli strumenti esistenti. L'imaging confocale dal vivo è stato eseguito utilizzando il colorante tetrametilrodamina estere metilico e l'ottimizzazione di routine è stata convalidata trattando le cellule neuronali con agonisti del recettore dell'acido retinoico (RAR), i cui effetti sui mitocondri neuronali sono stabiliti in letteratura. I risultati sono stati coerenti con la letteratura e hanno permesso un'ulteriore caratterizzazione del comportamento della rete mitocondriale in risposta alla modulazione RAR isoforma-specifica.

Questa nuova metodologia ha permesso una caratterizzazione rapida e validata della rete mitocondriale dell'intero neurone, ma consente anche la differenziazione tra mitocondri assone e corpo cellulare, una caratteristica essenziale da applicare nel campo delle neuroscienze. Inoltre, questo protocollo può essere applicato a esperimenti che utilizzano trattamenti ad azione rapida, consentendo l'imaging delle stesse cellule prima e dopo i trattamenti, trascendendo il campo delle neuroscienze.

Introduzione

I mitocondri cellulari sono al centro di tutti gli stati fisiologici e una comprensione approfondita della loro omeostasi (mitostasi) e del loro comportamento è fondamentale per aiutare a identificare il trattamento farmacologico per una vasta gamma di malattie, tra cui il cancro e il morbo di Alzheimer ^1,2.

I mitocondri svolgono ruoli cellulari cruciali nell'omeostasi energetica, nella generazione di ATP, nel tamponamento del calcio e nella regolazione dei ROS, e la mitostasi è essenziale per mantenere l'omeostasi proteica poiché gli chaperoni molecolari sono dipendenti dall'energi....

Protocollo

NOTA: Questo protocollo prevede due fasi principali: una fase di laboratorio umido, che coinvolge la coltura cellulare e la microscopia confocale dal vivo per ottenere immagini di mitocondri vivi (Figura 1) e una fase in silico per analizzare le immagini ottenute (Figura 2). Per l'analisi automatizzata dei dati dei mitocondri 3D con immagini dal vivo, è stata utilizzata l'applicazione MATLAB Mitometer fornita da Lefebvre et ^al.9. L'ottimizzazione di routine è scritta in MATLAB. Il software, le versioni aggiornate e le macro ImageJ per l'elaborazione sono disponibili gratuitame....

Discussione

L'imaging di cellule vive produce file di grandi dimensioni che richiedono una seria elaborazione informatica, ma anche gli strumenti più recenti richiedono un ampio input manuale per l'elaborazione. Questa ottimizzazione di routine si concentra sulla semplificazione del processo di analisi dei mitocondri sul mitometro perché questo strumento presenta un ottimo equilibrio tra l'input dell'utente e l'output dei dati. In precedenza è stato esaminato un confronto completo tra diversi strumenti per l'analisi delle immagin.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AM580	Sigma-Aldrich	A8843
BDNF	Thermo-Fisher	RP8642
BMS493	Tocris Bioscience	3409
CD2314	Tocris Bioscience	3824
Ch55	Tocris Bioscience	2020
Foetal Bovine Serum	Thermo-Fisher	10270106
GraphPad Prism v4.0	GraphPad Software, La Jolla	n/a
Ham’s F12 Nutrient Mix	Thermo-Fisher	21765029
MATLAB R2022a	MathWorks	n/a
Minimal Essential Medium	Thermo-Fisher	31095
Nunc Glass Bottom Dishes	Thermo-Fisher	150680
Phosphate Buffer Saline Solution	Thermo-Fisher	28372
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
TMRM	Thermo-Fisher	T668
Zeiss LSM 510	Carl Zeiss	n/a	Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective