A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
ניתוח אוטומטי אופטימלי של אפנון הומאוסטזיס מיטוכונדריה עצבית חיה על ידי קולטני חומצה רטינואית ספציפיים לאיזופורם
In This Article
Summary
הרשת המיטוכונדריאלית מורכבת ביותר, מה שהופך אותה למאתגרת מאוד לניתוח. כלי חדשני של MATLAB מנתח מיטוכונדריה עם תמונות קונפוקליות חיות בתמונות timelapse, אך התוצאה היא נפח פלט גדול הדורש תשומת לב ידנית אישית. כדי להתמודד עם בעיה זו, פותחה אופטימיזציה שגרתית, המאפשרת ניתוח קבצים מהיר.
Abstract
הרשת המיטוכונדריאלית המורכבת מאתגרת מאוד לפלח, לעקוב ולנתח תאים חיים. כלי MATLAB מאפשרים ניתוח מיטוכונדריה בקובצי timelapse, ובכך מפשטים ומאיצים באופן משמעותי את תהליך עיבוד התמונה. עם זאת, הכלים הקיימים מייצרים נפח פלט גדול, הדורש תשומת לב ידנית פרטנית, ולמערכי ניסוי בסיסיים יש פלט של אלפי קבצים, שכל אחד מהם דורש טיפול נרחב וגוזל זמן.
כדי להתמודד עם בעיות אלה, פותחה אופטימיזציה שגרתית, הן בקוד MATLAB והן בטופסי סקריפט חי, המאפשרת ניתוח קבצים מהיר ומפחיתה משמעותית את קריאת המסמכים ועיבוד הנתונים. עם מהירות של 100 קבצים לדקה, האופטימיזציה מאפשרת ניתוח מהיר כולל. המיטוב משיג את תפוקת התוצאות על ידי ממוצע נתונים ספציפיים למסגרת עבור מיטוכונדריה בודדים לאורך מסגרות זמן, ניתוח נתונים באופן מוגדר, עקבי עם אלה פלט מכלים קיימים. הדמיה קונפוקלית חיה בוצעה באמצעות הצבע טטרמתילרודאמין מתיל אסטר, והאופטימיזציה השגרתית אומתה על ידי טיפול בתאים עצביים עם אגוניסטים לקולטן חומצה רטינואית (RAR), שהשפעתם על מיטוכונדריה עצבית מבוססת בספרות. התוצאות תאמו את הספרות ואפשרו אפיון נוסף של התנהגות הרשת המיטוכונדריאלית בתגובה לאפנון RAR ספציפי לאיזופורם.
מתודולוגיה חדשה זו אפשרה אפיון מהיר ותקף של רשת מיטוכונדריה של נוירונים שלמים, אך היא גם מאפשרת הבחנה בין אקסון למיטוכונדריה של גוף התא, תכונה חיונית ליישום בתחום מדעי המוח. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על ניסויים באמצעות טיפולים מהירים, המאפשר הדמיה של אותם תאים לפני ואחרי טיפולים, מעבר לתחום מדעי המוח.
Introduction
מיטוכונדריה תאית ניצבת במרכז כל המצבים הפיזיולוגיים, והבנה מעמיקה של ההומאוסטזיס (מיטוסטזיס) והתנהגותם היא בעלת חשיבות עליונה כדי לסייע בזיהוי טיפול תרופתי למגוון רחב של מחלות, כולל סרטן ואלצהיימר 1,2.
מיטוכונדריה ממלאים תפקידים תאיים מכריעים בהומאוסטזיס אנרגיה, בייצור ATP, בחציצה של סידן ובוויסות ROS, ומיטוסטאזיס חיוני לשמירה על הומאוסטזיס חלבונים, שכן מלווים מולקולריים תלויים באנרגיה3. אלה דורשים אפנון רשת קבוע ודינמי והסתגלות כדי לענות ביעילות על הצרכים התאיים, והעברת המיטוכונדריה מווסתת על ידי מסלולי איתות שונים; עבודות קודמות תיארו מסלול אחד כזה, זה של ק....
Protocol
הערה: לפרוטוקול הזה יש שני שלבים עיקריים: שלב מעבדה רטוב, הכולל תרבית תאים ומיקרוסקופ קונפוקלי חי כדי לקבל תמונות של מיטוכונדריה חיים (איור 1), ושלב בסיליקו כדי לנתח תמונות שהתקבלו (איור 2). לניתוח נתונים אוטומטי של מיטוכונדריה תלת-ממדית בהדמיה חיה, נעשה שימוש במיטומטר של יישום MATLAB כפי שסופק על ידי Lefebvre et al.9. האופטימיזציה השגרתית כתובה ב-MATLAB. התוכנה, הגרסאות המעודכנות ועיבוד פקודות המאקרו של ImageJ זמינים באופן חופשי באינטרנט דרך GitHub, בשעה https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB.
1. מיקרוסקופ חי<....
תוצאות
כדי לשפר ולהאיץ את הניתוח של קבצי פלט בפורמט .txt, קודד אופטימיזציה שגרתית הקוראת נתונים התואמים למיטומטר .txt קבצי פלט, עם עמודות המייצגות מסגרת וקווים המייצגים מיטוכונדריה מזוהים. המיטוב השגרתי מפיק נתונים בערך יחיד לכל פרמטר על ידי ממוצע המסגרות עבור כל מיטוכונדריה מזוהה ולאחר מכן ממוצע ה.......
Discussion
דימות תאים חי מייצר קבצים גדולים הדורשים עיבוד מחשוב רציני, אך אפילו הכלים העדכניים ביותר דורשים קלט ידני נרחב לעיבוד. אופטימיזציה שגרתית זו מתמקדת בפישוט תהליך ניתוח המיטוכונדריה במיטומטר מכיוון שכלי זה מציג איזון טוב מאוד בין קלט המשתמש לפלט הנתונים. השוואה מקיפה בין כלים שונים לניתוח .......
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgements
רכישת התמונה בוצעה במתקן LiM של iBiMED, צומת של PPBI (פלטפורמה פורטוגזית של BioImaging): POCI-01-0145-FEDER-022122. עבודה זו נתמכה על ידי FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276), מענק ל- DT מ- Fundação para a Ciência e Tecnologia of the Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), מענק מ- ATG-The Gabba Alumni Association לסמנכ"ל, והמכון לביו-רפואה-iBiMED, אוניברסיטת אביירו.
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
References
- Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and cancer.
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved