通过亚型特异性视黄酸受体对活神经元线粒体稳态调节进行优化的自动分析

摘要

线粒体网络极其复杂，因此分析起来非常具有挑战性。一种新颖的MATLAB工具可分析延时摄影图像中的实时共聚焦成像线粒体，但输出量很大，需要单独手动操作。为了解决这个问题，开发了一个例行优化，允许快速的文件分析。

摘要

复杂的线粒体网络使得分割、跟踪和分析活细胞变得非常具有挑战性。MATLAB 工具允许分析延时文件中的线粒体，从而大大简化和加快图像处理过程。尽管如此，现有工具产生的输出量很大，需要单独的手动关注，并且基本的实验设置有数千个文件的输出，每个文件都需要大量且耗时的处理。

为了解决这些问题，我们开发了一种例行优化，包括 MATLAB 代码和实时脚本形式，允许快速进行文件分析并显着减少文档读取和数据处理。以 100 个文件/分钟的速度，优化允许整体快速分析。优化通过在整个时间范围内对单个线粒体的特定帧数据进行平均，以定义的方式分析数据，与现有工具的输出一致，从而实现结果输出。使用染料四甲基罗丹明甲酯进行实时共聚焦成像，并通过用视黄酸受体 （RAR） 激动剂处理神经元细胞来验证常规优化，其对神经元线粒体的影响已在文献中确定。结果与文献一致，并允许进一步表征线粒体网络行为以响应亚型特异性 RAR 调节。

这种新方法可以快速和验证全神经元线粒体网络的表征，但它也允许区分轴突和细胞体线粒体，这是应用于神经科学领域的基本特征。此外，该协议可应用于使用速效治疗的实验，允许在治疗前后对相同的细胞进行成像，超越了神经科学领域。

引言

细胞线粒体位于所有生理状态的中心，透彻了解它们的稳态（有丝分裂）和行为对于帮助确定各种疾病（包括癌症和阿尔茨海默病）的药物治疗至关重要 ^1,2。

线粒体在能量稳态、ATP 生成、钙缓冲和 ROS 调节中起着至关重要的细胞作用，而有丝分裂对于维持蛋白质稳态至关重要，因为分子伴侣是能量依赖性的³。这些需要持续和动态的网络调制和适应才能有效地满足细胞需求，并且线粒体转运受不同信号通路的调节;以前的工作已经描述了一种这样的途径，即视黄酸受体 （RAR） ^4,5。视黄酸 （RA） 通过 RAR 激活促进轴突和神经突的生长。在小鼠原代皮层神经元中，RAR-β 的激活可促进神经突中的线粒体生长、速度和活动性⁶。

考虑到线粒体网络的适应性和动态性，“实时”评估有丝分裂的可能性不仅对于研究能量稳态至关重要，而且对于蛋白稳态、细胞健康、增殖或信号传导也至关重要。评估有丝分裂的常用方法依赖于使用荧光染料或标记物突出线粒体后进行共聚焦显微镜检查，以及允许温度和/或 CO₂ 调节的特定显微镜设置

研究方案

注意：该协议有两个主要步骤：湿实验室步骤，涉及细胞培养和活共聚焦显微镜以获得活线粒体的图像（图1）和 计算机步骤分析 获得的图像（图2）。为了对 3D 实时成像线粒体进行自动数据分析，使用了 Lefebvre 等人提供的 MATLAB 应用程序 ^Mitometer9。例程优化是用 MATLAB 编写的。该软件、更新版本和处理 ImageJ 宏可通过 GitHub 免费在线获得，网址为 https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB。

1. 活体显微镜

图1：实验方案。对SH-SY5Y细胞进行分化并用类视黄醇处理。....

结果

为了增强和加速对.txt格式输出文件的分析，对例程优化进行了编码，该优化读取与Mitometer一致的数据.txt输出文件，列表示帧，线表示已识别的线粒体。例程优化通过对每个已识别线粒体的帧进行平均，然后对每个视野中所有线粒体的结果进行平均，从而为每个参数生成单个值的数据。开发的例程从编号从 1 向上的文件夹中读取文件。Live Script 例程优化以表格格式输出单个电子表格文件。在此输?.......

讨论

活细胞成像产生的大文件需要大量的计算处理，但即使是最新的工具也需要大量的手动输入来处理。这种常规优化的重点是简化线粒体计上的线粒体分析过程，因为该工具在用户输入和数据输出之间实现了非常好的平衡。之前已经回顾了不同线粒体图像分析工具之间的全面比较¹⁰.虽然其他管道更侧重于分析线粒体网络和簇质量或分析膜电位变化，但这里介绍的这种新方法可以快?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AM580	Sigma-Aldrich	A8843
BDNF	Thermo-Fisher	RP8642
BMS493	Tocris Bioscience	3409
CD2314	Tocris Bioscience	3824
Ch55	Tocris Bioscience	2020
Foetal Bovine Serum	Thermo-Fisher	10270106
GraphPad Prism v4.0	GraphPad Software, La Jolla	n/a
Ham’s F12 Nutrient Mix	Thermo-Fisher	21765029
MATLAB R2022a	MathWorks	n/a
Minimal Essential Medium	Thermo-Fisher	31095
Nunc Glass Bottom Dishes	Thermo-Fisher	150680
Phosphate Buffer Saline Solution	Thermo-Fisher	28372
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
TMRM	Thermo-Fisher	T668
Zeiss LSM 510	Carl Zeiss	n/a	Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective