Análise Automatizada Otimizada da Modulação da Homeostase das Mitocôndrias Neuronais Vivas por Receptores de Ácido Retinóico Isoform-Específicos

Resumo

A rede mitocondrial é extremamente complexa, tornando-a muito difícil de analisar. Uma nova ferramenta MATLAB analisa mitocôndrias confocais ao vivo em imagens de timelapse, mas resulta em um grande volume de saída que requer atenção manual individual. Para resolver esse problema, uma otimização de rotina foi desenvolvida, permitindo uma análise rápida dos arquivos.

Resumo

A complexa rede mitocondrial torna muito desafiador segmentar, acompanhar e analisar células vivas. As ferramentas MATLAB permitem a análise de mitocôndrias em arquivos timelapse, simplificando e acelerando consideravelmente o processo de processamento de imagens. No entanto, as ferramentas existentes produzem um grande volume de saída, exigindo atenção manual individual, e as configurações experimentais básicas têm uma saída de milhares de arquivos, cada um exigindo manuseio extenso e demorado.

Para resolver essas questões, uma otimização de rotina foi desenvolvida, tanto em código MATLAB quanto em formulários live-script, permitindo uma análise rápida de arquivos e reduzindo significativamente a leitura de documentos e o processamento de dados. Com uma velocidade de 100 arquivos/min, a otimização permite uma análise geral rápida. A otimização alcança a saída de resultados pela média de dados específicos de quadros para mitocôndrias individuais ao longo de períodos de tempo, analisando dados de maneira definida, consistente com a saída de ferramentas existentes. Imagens confocais ao vivo foram realizadas usando o corante tetrametilrodamina éster, e a otimização de rotina foi validada pelo tratamento de células neuronais com agonistas do receptor do ácido retinóico (RAR), cujos efeitos sobre as mitocôndrias neuronais estão estabelecidos na literatura. Os resultados foram consistentes com a literatura e permitiram uma caracterização mais detalhada do comportamento das redes mitocondriais em resposta à modulação RAR isoform-específica.

Esta nova metodologia permitiu a caracterização rápida e validada da rede mitocondrial de neurônios inteiros, mas também permite a diferenciação entre axônio e mitocôndrias de corpo celular, uma característica essencial para aplicação no campo da neurociência. Além disso, esse protocolo pode ser aplicado a experimentos utilizando tratamentos de ação rápida, permitindo a obtenção de imagens das mesmas células antes e após os tratamentos, transcendendo o campo da neurociência.

Introdução

As mitocôndrias celulares estão no centro de todos os estados fisiológicos, e uma compreensão completa de sua homeostase (mitostase) e comportamento é fundamental para auxiliar na identificação do tratamento farmacológico para uma ampla gama de doenças, incluindo câncer e doença de Alzheimer ^1,2.

As mitocôndrias desempenham papéis celulares cruciais na homeostase energética, geração de ATP, tamponamento de cálcio e regulação de EROs, e a mitostase é essencial para manter a homeostase proteica, uma vez que as chaperonas moleculares são dependentes de energia³.....

Protocolo

OBS: Este protocolo tem duas etapas principais: uma etapa de laboratório úmido, envolvendo cultura de células e microscopia confocal viva para obtenção de imagens de mitocôndrias vivas (Figura 1) e uma etapa in silico para análise das imagens obtidas (Figura 2). Para a análise automatizada dos dados de mitocôndrias com imagens ao vivo em 3D, foi utilizado o mitômetro de aplicação MATLAB, conforme fornecido por Lefebvre et ^al.9. A otimização de rotina é escrita no MATLAB. O software, as versões atualizadas e o processamento de Macros ImageJ estão disponíveis gratuitamente on-li....

Discussão

A imagem de células vivas produz arquivos grandes que exigem processamento de computação sério, mas mesmo as ferramentas mais recentes exigem extensa entrada manual para processar. Esta otimização de rotina é focada em simplificar o processo de análise de mitocôndrias no Mitômetro, pois esta ferramenta apresenta um equilíbrio muito bom entre a entrada do usuário e a saída de dados. Uma comparação abrangente entre diferentes ferramentas para análise de imagens mitocondriais foi previamente revisada

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AM580	Sigma-Aldrich	A8843
BDNF	Thermo-Fisher	RP8642
BMS493	Tocris Bioscience	3409
CD2314	Tocris Bioscience	3824
Ch55	Tocris Bioscience	2020
Foetal Bovine Serum	Thermo-Fisher	10270106
GraphPad Prism v4.0	GraphPad Software, La Jolla	n/a
Ham’s F12 Nutrient Mix	Thermo-Fisher	21765029
MATLAB R2022a	MathWorks	n/a
Minimal Essential Medium	Thermo-Fisher	31095
Nunc Glass Bottom Dishes	Thermo-Fisher	150680
Phosphate Buffer Saline Solution	Thermo-Fisher	28372
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
TMRM	Thermo-Fisher	T668
Zeiss LSM 510	Carl Zeiss	n/a	Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective