توليد خطوط خلايا خروج المغلوب المرتبطة بالسنترومير Protein-E CENP-E-/- باستخدام نظام كريسبر / كاس 9

Summary

تشير هذه المقالة إلى بناء خلايا خروج المغلوب المرتبطة بالبروتين E (CENP-E) باستخدام نظام CRISPR / Cas9 وثلاث استراتيجيات فحص قائمة على النمط الظاهري. لقد استخدمنا خط الخلايا الضربة القاضية CENP-E لإنشاء نهج جديد للتحقق من خصوصية وسمية مثبطات CENP-E ، وهو أمر مفيد لتطوير الأدوية والبحوث البيولوجية.

Abstract

برز نظام كريسبر (التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام) / Cas9 كأداة قوية لتحرير الجينات بدقة وكفاءة في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية. البروتين E المرتبط بالسنترومير (CENP-E) هو كينيسين موجه بنهاية زائد مطلوب لالتقاط الأنابيب الدقيقة الحركية ، ومحاذاة الكروموسوم ، ونقطة تفتيش تجميع المغزل. على الرغم من أن الوظائف الخلوية لبروتينات CENP-E قد تمت دراستها جيدا ، فقد كان من الصعب دراسة الوظائف المباشرة لبروتينات CENP-E باستخدام البروتوكولات التقليدية لأن استئصال CENP-E يؤدي عادة إلى تنشيط نقطة تفتيش تجميع المغزل ، وتوقف دورة الخلية ، وموت الخلايا. في هذه الدراسة ، قمنا بإخراج جين CENP-E تماما في خلايا HeLa البشرية ونجحنا في إنشاء خلايا CENP-E^-/- HeLa باستخدام نظام CRISPR / Cas9.

تم إنشاء ثلاث استراتيجيات فحص محسنة قائمة على النمط الظاهري ، بما في ذلك فحص مستعمرة الخلايا ، والأنماط الظاهرية لمحاذاة الكروموسومات ، وشدة الفلورسنت لبروتينات CENP-E ، والتي تعمل بشكل فعال على تحسين كفاءة الفحص ومعدل النجاح التجريبي لخلايا CENP-E بالضربة القاضية. الأهم من ذلك ، أن حذف CENP-E يؤدي إلى اختلال الكروموسوم ، والموقع غير الطبيعي لبروتينات نقطة التفتيش الانقسامية BUB1 سيرين / ثريونين كيناز B (BubR1) ، والعيوب الانقسامية. علاوة على ذلك ، استخدمنا نموذج خلية HeLa بالضربة القاضية CENP-E لتطوير طريقة تحديد مثبطات CENP-E المحددة.

في هذه الدراسة ، تم وضع نهج مفيد للتحقق من خصوصية وسمية مثبطات CENP-E. علاوة على ذلك ، تقدم هذه الورقة بروتوكولات تحرير الجينات CENP-E باستخدام نظام CRISPR / Cas9 ، والذي يمكن أن يكون أداة قوية للتحقيق في آليات CENP-E في انقسام الخلايا. علاوة على ذلك ، سيساهم خط الخلايا الضربة القاضية CENP-E في اكتشاف مثبطات CENP-E والتحقق من صحتها ، والتي لها آثار مهمة على تطوير الأدوية المضادة للأورام ، ودراسات آليات انقسام الخلايا في بيولوجيا الخلية ، والتطبيقات السريرية.

Introduction

يتوسط تحرير الجينوم الهندسي التعديلات المستهدفة للجينات في مجموعة متنوعة من الخلايا والكائنات الحية. في حقيقيات النوى ، يمكن إدخال طفرات خاصة بالموقع من خلال تطبيقات النيوكليازات الخاصة بالتسلسل التي تحفز إعادة التركيب المتماثل للحمض النووي^{المستهدف 1}. في السنوات الأخيرة ، تم تصميم العديد من تقنيات تحرير الجينوم ، بما في ذلك نوكلياز إصبع الزنك (ZFNs) ^2,3 ، والنوكليازات المستجيبة الشبيهة بمنشط النسخ (TALENs^{) 4,5} ، و meganucleases ^6,7 ، لشق الجينومات في مواقع محددة ، ولكن هذه الأساليب تتطلب هندسة ....

Protocol

1. بناء ناقلات الضربة القاضية الجينية CRISPR / Cas9

1. حدد تسلسل الحمض النووي الجينومي المستهدف على جين CENP-E البشري (GenBank Accession No. NM_001286734.2) وتصميم sgRNA باستخدام أداة تصميم CRISPR عبر الإنترنت (http://crispor.tefor.net/).
2. أدخل تسلسلا جينوميا واحدا ، وحدد جينوم "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (مجموعة تحليل hg38) + تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs): dbSNP148" ، وحدد الشكل المجاور للفضاء الأولي "20 bp-NGG-spCas9". اختر تسلسلين دليليين ، بما في ذلك sgRNA-1 و 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' و sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3' ، وفقا لدرجات الخصوصية⁵⁰ ، والكفاءة المتوقعة

النتائج

تم إنشاء خلايا CENP-E^-/- HeLa بنجاح باستخدام نظام CRISPR / Cas9 (الشكل 1). يوضح الشكل 1 الجدول الزمني والخطوات التجريبية الحرجة لهذه الطريقة. أولا ، قمنا بتصميم وتوليف sgRNAs الخاصة ب CENP-E ، وقمنا بتلدين وربط sgRNAs في بلازميد pX458 ، ونقل البلازميد إلى خلايا HeLa ، و?.......

Discussion

Kinesin-7 CENP-E هو منظم رئيسي في محاذاة الكروموسوم ونقطة تفتيش تجميع المغزل أثناء انقسام الخلايا^17،19،20. عادة ما يؤدي الحذف الجيني ل CENP-E إلى تنشيط نقطة تفتيش تجميع المغزل ، وإيقاف دورة الخلية ، وموت الخلايا^{27،29،.......}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.5 mL centrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
24-well plate	Corning	3524
4S Gelred, 10,000x in water	Sangon Biotech (Shanghai)	A616697
50 mL centrifuge tube	Corning	430828
6 cm Petri dish	Corning	430166
95% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	10009164
96-well plate	Corning	3599
Acetic acid	Sinopharm Chemical Reagent	10000218	Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai)	A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0428	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Beyotime	A0423	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0460	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab254326	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376392	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab133583	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium	Beyotime	P0131	Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody	Abcam	ab7291	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer	Biotek Instruments	Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sinopharm Chemical Reagent	69003435
BpiI (BbsI)	Thermo Fisher Scientific	ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay	Promega	G3580
Centrifuge	Eppendorf	5424BK745380
Colchicine	Sinopharm Chemical Reagent	61001563
Confocal scanning microscope	Leica	Leica TCS SP8
Coverslip	CITOTEST	80344-1220
DAPI	Beyotime	C1006
DH5α competent cells	Sangon Biotech (Shanghai)	B528413
DL2000 DNA marker	TaKaRa	3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit	Omega	D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518251
Fetal bovine serum	Zhejiang Tianhang Biotechnology	11011-8611
Gentian violet	Sinopharm Chemical Reagent	71019944	Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution	Sinopharm Chemical Reagent	71020260
GraphPad Prism version 8.0 software	GraphPad	www.graphpad.com	Statistical analysis.
GSK923295	MedChemExpress	HY-10299
HeLa cell line	ATCC	CCL-2
Humidified incubator	Heal Force	HF90/HF240
Image J software	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	Image processing and analysis.
Inverted microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics	XD-202
LB agar powder	Sangon Biotech (Shanghai)	A507003
Lipo6000 transfection reagent	Beyotime	C0526
Nikon Ti-S2 microscope	Nikon	Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985070
Paraformaldehyde	Sinopharm Chemical Reagent	80096618	Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution	HyClone	SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518191
T4 DNA ligase	TaKaRa	2011A
T4 polynucleotide kinase	TaKaRa	2021A
TaKaRa Ex Taq	TaKaRa	RR001A
Triton X-100	Sinopharm Chemical Reagent	30188928	Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20	Sinopharm Chemical Reagent	30189328	Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.