Generación de líneas celulares knockout de proteína E CENP-E-/- asociadas al centrómero utilizando el sistema CRISPR/Cas9

Resumen

En este artículo se informa de la construcción de células knockout de proteína E asociada al centrómero (CENP-E) utilizando el sistema CRISPR/Cas9 y tres estrategias de cribado basadas en el fenotipo. Hemos utilizado la línea celular knockout CENP-E para establecer un enfoque novedoso para validar la especificidad y toxicidad de los inhibidores de CENP-E, que es útil para el desarrollo de fármacos y la investigación biológica.

Resumen

El sistema CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas)/Cas9 se ha convertido en una poderosa herramienta para la edición genética precisa y eficiente en una variedad de organismos. La proteína E ASOCIADA AL CENTRÓMERO (CENP-E) es una quinesina dirigida al extremo positivo necesaria para la captura del cinetocoro-microtúbulo, la alineación cromosómica y el punto de control de ensamblaje del huso. Aunque las funciones celulares de las proteínas CENP-E han sido bien estudiadas, ha sido difícil estudiar las funciones directas de las proteínas CENP-E utilizando protocolos tradicionales porque la ablación de CENP-E generalmente conduce a la activación del punto de control del ensamblaje del huso, la detención del ciclo celular y la muerte celular. En este estudio, hemos eliminado por completo el gen CENP-E en células HeLa humanas y hemos generado con éxito las células CENP-E^-/- HeLa utilizando el sistema CRISPR/Cas9.

Se establecieron tres estrategias optimizadas de cribado basadas en el fenotipo, que incluyen el cribado de colonias celulares, los fenotipos de alineación cromosómica y las intensidades fluorescentes de las proteínas CENP-E, que mejoran eficazmente la eficacia del cribado y la tasa de éxito experimental de las células knockout CENP-E . Es importante destacar que la deleción de CENP-E da lugar a una desalineación cromosómica, a la localización anormal de las proteínas serina/treonina quinasa B (BubR1) del punto de control mitótico BUB1 y a defectos mitóticos. Además, hemos utilizado el modelo de células HeLa knockout de CENP-E para desarrollar un método de identificación de inhibidores específicos de CENP-E.

En este estudio, se ha establecido un enfoque útil para validar la especificidad y toxicidad de los inhibidores de CENP-E. Además, en este trabajo se presentan los protocolos de edición génica de CENP-E utilizando el sistema CRISPR/Cas9, que podría ser una poderosa herramienta para investigar los mecanismos de CENP-E en la división celular. Además, la línea celular knockout de CENP-E contribuiría al descubrimiento y validación de inhibidores de CENP-E, que tienen importantes implicaciones para el desarrollo de fármacos antitumorales, estudios de mecanismos de división celular en biología celular y aplicaciones clínicas.

Introducción

La edición genómica modificada media las modificaciones específicas de los genes en una variedad de células y organismos. En eucariotas, la mutagénesis específica del sitio puede introducirse mediante la aplicación de nucleasas específicas de secuencia que estimulan la recombinación homóloga del ADN diana¹. En los últimos años, se han diseñado varias tecnologías de edición del genoma, incluidas las nucleasas de dedos de zinc (ZFN)^2,3, las nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN)^4,5 y las meganucleasas homing

Protocolo

1. Construcción de los vectores knockout del gen CRISPR/Cas9

1. Seleccione la secuencia de ADN genómico diana en el gen CENP-E humano (Acceso GenBank No. NM_001286734.2) y diseñar el sgRNA utilizando una herramienta de diseño CRISPR en línea (http://crispor.tefor.net/).
2. Introduzca una sola secuencia genómica, seleccione el genoma de "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (conjunto de análisis hg38) + polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs): dbSNP148", y seleccione el motivo adyacente del protoespaciador "20 bp-NGG-spCas9". Elija dos secuencias guía, que incluyen sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' y sgRNA-2 5'-TTCTTTAG....

Discusión

La quinesina-7 CENP-E es un regulador clave en la alineación cromosómica y el punto de control de ensamblaje del huso durante la división celular 17,19,20. La deleción genética de CENP-E generalmente resulta en la activación del punto de control del ensamblaje del huso, la detención del ciclo celular y la muerte celular 27,29,51,52.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.5 mL centrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
24-well plate	Corning	3524
4S Gelred, 10,000x in water	Sangon Biotech (Shanghai)	A616697
50 mL centrifuge tube	Corning	430828
6 cm Petri dish	Corning	430166
95% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	10009164
96-well plate	Corning	3599
Acetic acid	Sinopharm Chemical Reagent	10000218	Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai)	A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0428	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Beyotime	A0423	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0460	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab254326	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376392	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab133583	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium	Beyotime	P0131	Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody	Abcam	ab7291	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer	Biotek Instruments	Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sinopharm Chemical Reagent	69003435
BpiI (BbsI)	Thermo Fisher Scientific	ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay	Promega	G3580
Centrifuge	Eppendorf	5424BK745380
Colchicine	Sinopharm Chemical Reagent	61001563
Confocal scanning microscope	Leica	Leica TCS SP8
Coverslip	CITOTEST	80344-1220
DAPI	Beyotime	C1006
DH5α competent cells	Sangon Biotech (Shanghai)	B528413
DL2000 DNA marker	TaKaRa	3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit	Omega	D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518251
Fetal bovine serum	Zhejiang Tianhang Biotechnology	11011-8611
Gentian violet	Sinopharm Chemical Reagent	71019944	Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution	Sinopharm Chemical Reagent	71020260
GraphPad Prism version 8.0 software	GraphPad	www.graphpad.com	Statistical analysis.
GSK923295	MedChemExpress	HY-10299
HeLa cell line	ATCC	CCL-2
Humidified incubator	Heal Force	HF90/HF240
Image J software	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	Image processing and analysis.
Inverted microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics	XD-202
LB agar powder	Sangon Biotech (Shanghai)	A507003
Lipo6000 transfection reagent	Beyotime	C0526
Nikon Ti-S2 microscope	Nikon	Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985070
Paraformaldehyde	Sinopharm Chemical Reagent	80096618	Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution	HyClone	SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518191
T4 DNA ligase	TaKaRa	2011A
T4 polynucleotide kinase	TaKaRa	2021A
TaKaRa Ex Taq	TaKaRa	RR001A
Triton X-100	Sinopharm Chemical Reagent	30188928	Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20	Sinopharm Chemical Reagent	30189328	Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.