Génération de lignées cellulaires knock-out Protein-E CENP-E-/- associées au centromère à l’aide du système CRISPR/Cas9

Résumé

Cet article rapporte la construction de cellules knock-out de la protéine E associée au centromère (CENP-E) à l’aide du système CRISPR/Cas9 et de trois stratégies de criblage basées sur le phénotype. Nous avons utilisé la lignée cellulaire knock-out CENP-E pour établir une nouvelle approche visant à valider la spécificité et la toxicité des inhibiteurs de CENP-E, ce qui est utile pour le développement de médicaments et la recherche biologique.

Résumé

Le système CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 est apparu comme un outil puissant pour une édition de gènes précise et efficace dans une variété d’organismes. La protéine E associée au centromère (CENP-E) est une kinésine dirigée vers l’extrémité positive nécessaire à la capture des kinétochores-microtubules, à l’alignement des chromosomes et au point de contrôle de l’assemblage du fuseau. Bien que les fonctions cellulaires des protéines CENP-E aient été bien étudiées, il a été difficile d’étudier les fonctions directes des protéines CENP-E à l’aide de protocoles traditionnels, car l’ablation de CENP-E conduit généralement à l’activation du point de contrôle de l’assemblage du fuseau, à l’arrêt du cycle cellulaire et à la mort cellulaire. Dans cette étude, nous avons complètement éliminé le gène CENP-E dans les cellules HeLa humaines et réussi à générer les cellules CENP-E^-/- HeLa à l’aide du système CRISPR/Cas9.

Trois stratégies de criblage optimisées basées sur le phénotype ont été établies, y compris le criblage des colonies cellulaires, les phénotypes d’alignement des chromosomes et les intensités fluorescentes des protéines CENP-E, qui améliorent efficacement l’efficacité du criblage et le taux de réussite expérimentale des cellules knock-out CENP-E . Il est important de noter que la délétion CENP-E entraîne un désalignement des chromosomes, la localisation anormale des protéines sérine/thréonine kinase B (BubR1) du point de contrôle mitotique BUB1 et des défauts mitotiques. De plus, nous avons utilisé le modèle de cellules HeLa knock-out CENP-E pour développer une méthode d’identification des inhibiteurs spécifiques de CENP-E.

Dans cette étude, une approche utile pour valider la spécificité et la toxicité des inhibiteurs de CENP-E a été établie. De plus, cet article présente les protocoles d’édition du génome CENP-E à l’aide du système CRISPR/Cas9, qui pourrait être un outil puissant pour étudier les mécanismes de CENP-E dans la division cellulaire. De plus, la lignée cellulaire knock-out CENP-E contribuerait à la découverte et à la validation des inhibiteurs de CENP-E, qui ont des implications importantes pour le développement de médicaments antitumoraux, les études des mécanismes de division cellulaire en biologie cellulaire et les applications cliniques.

Introduction

L’édition du génome par ingénierie médie les modifications ciblées des gènes dans une variété de cellules et d’organismes. Chez les eucaryotes, la mutagénèse spécifique au site peut être introduite par l’application de nucléases spécifiques à la séquence qui stimulent la recombinaison homologue de l’ADN^{cible 1}. Ces dernières années, plusieurs technologies d’édition du génome, notamment les nucléases à doigts de zinc (ZFN)^2,3, les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN)^4,5 et les méganucléases à tête chercheuse

Protocole

1. Construction des vecteurs d’inactivation du gène CRISPR/Cas9

1. Sélectionner la séquence d’ADN génomique cible sur le gène CENP-E humain (numéro d’enregistrement GenBank. NM_001286734.2) et concevoir l’ARNsg à l’aide d’un outil de conception CRISPR en ligne (http://crispor.tefor.net/).
2. Entrez une seule séquence génomique, sélectionnez le génome de « Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + single nucleotide polymorphisms (SNPs) : dbSNP148 », et sélectionnez le motif adjacent protospacer « 20 bp-NGG-spCas9 ». Choisissez deux séquences guides, dont sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' et sgRNA-2 5'-TTCT....

Discussion

La kinésine-7 CENP-E est un régulateur clé de l’alignement des chromosomes et du point de contrôle de l’assemblage du fuseau pendant la division cellulaire 17,19,20. La délétion génétique de CENP-E entraîne généralement l’activation du point de contrôle de l’assemblage du fuseau, l’arrêt du cycle cellulaire et la mort cellulaire 27,29,51,52.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.5 mL centrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
24-well plate	Corning	3524
4S Gelred, 10,000x in water	Sangon Biotech (Shanghai)	A616697
50 mL centrifuge tube	Corning	430828
6 cm Petri dish	Corning	430166
95% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	10009164
96-well plate	Corning	3599
Acetic acid	Sinopharm Chemical Reagent	10000218	Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai)	A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0428	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Beyotime	A0423	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0460	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab254326	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376392	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab133583	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium	Beyotime	P0131	Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody	Abcam	ab7291	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer	Biotek Instruments	Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sinopharm Chemical Reagent	69003435
BpiI (BbsI)	Thermo Fisher Scientific	ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay	Promega	G3580
Centrifuge	Eppendorf	5424BK745380
Colchicine	Sinopharm Chemical Reagent	61001563
Confocal scanning microscope	Leica	Leica TCS SP8
Coverslip	CITOTEST	80344-1220
DAPI	Beyotime	C1006
DH5α competent cells	Sangon Biotech (Shanghai)	B528413
DL2000 DNA marker	TaKaRa	3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit	Omega	D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518251
Fetal bovine serum	Zhejiang Tianhang Biotechnology	11011-8611
Gentian violet	Sinopharm Chemical Reagent	71019944	Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution	Sinopharm Chemical Reagent	71020260
GraphPad Prism version 8.0 software	GraphPad	www.graphpad.com	Statistical analysis.
GSK923295	MedChemExpress	HY-10299
HeLa cell line	ATCC	CCL-2
Humidified incubator	Heal Force	HF90/HF240
Image J software	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	Image processing and analysis.
Inverted microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics	XD-202
LB agar powder	Sangon Biotech (Shanghai)	A507003
Lipo6000 transfection reagent	Beyotime	C0526
Nikon Ti-S2 microscope	Nikon	Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985070
Paraformaldehyde	Sinopharm Chemical Reagent	80096618	Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution	HyClone	SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518191
T4 DNA ligase	TaKaRa	2011A
T4 polynucleotide kinase	TaKaRa	2021A
TaKaRa Ex Taq	TaKaRa	RR001A
Triton X-100	Sinopharm Chemical Reagent	30188928	Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20	Sinopharm Chemical Reagent	30189328	Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.