CRISPR/Cas9システムを用いたセントロメア関連プロテイン-E CENP-E-/-ノックアウト細胞株の作製

要約

本稿では、CRISPR/Cas9システムと3つの表現型ベースのスクリーニング戦略を用いたセントロメア関連プロテインE(CENP-E)ノックアウト細胞の構築について報告します。私たちは、 CENP-Eノックアウト細胞株を利用して、CENP-E阻害剤の特異性と毒性を検証するための新しいアプローチを確立し、医薬品開発や生物学研究に有用です。

要約

CRISPR(clustered regular interspaced short palindromic repeats)/Cas9システムは、さまざまな生物において正確かつ効率的な遺伝子編集のための強力なツールとして登場しました。セントロメア関連プロテインE(CENP-E)は、動原体微小管の捕捉、染色体アライメント、および紡錘体アセンブリチェックポイントに必要なプラス末端指向性キネシンです。CENP-Eタンパク質の細胞機能は十分に研究されていますが、CENP-Eアブレーションは通常、紡錘体アセンブリチェックポイントの活性化、細胞周期の停止、および細胞死につながるため、従来のプロトコルを使用してCENP-Eタンパク質の直接的な機能を研究することは困難でした。本研究では、ヒトHeLa細胞の CENP-E 遺伝子を完全にノックアウトし、CRISPR/Cas9システムを用いて CENP-E^-/- HeLa細胞を作製することに成功しました。

細胞コロニースクリーニング、染色体アライメント表現型、CENP-Eタンパク質の蛍光強度など、3つの最適化された表現型ベースのスクリーニング戦略が確立され、 CENP-E ノックアウト細胞のスクリーニング効率と実験成功率を効果的に向上させました。重要なことに、 CENP-Eの 欠失は、染色体のミスアライメント、BUB1有糸分裂チェックポイントセリン/スレオニンキナーゼB(BubR1)タンパク質の異常な位置、および有糸分裂欠損をもたらします。さらに、 CENP-E ノックアウトHeLa細胞モデルを用いて、CENP-E特異的阻害剤の同定法を開発しました。

この研究では、CENP-E阻害剤の特異性と毒性を検証するための有用なアプローチが確立されました。さらに、この論文では、細胞分裂におけるCENP-Eのメカニズムを調査するための強力なツールとなる可能性のあるCRISPR/Cas9システムを使用した CENP-E 遺伝子編集のプロトコルを提示します。さらに、 CENP-Eノックアウト細胞株は、抗腫瘍薬の開発、細胞生物学における細胞分裂メカニズムの研究、および臨床応用に重要な意味を持つCENP-E阻害剤の発見と検証に貢献します。

概要

遺伝子操作によるゲノム編集は、さまざまな細胞や生物の遺伝子の標的修飾を媒介します。真核生物では、標的DNA^の相同組換えを刺激する配列特異的ヌクレアーゼの応用により、部位特異的な突然変異誘発を導入することができます1。近年、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)^2,3、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)^4,5、ホーミングメガヌクレアーゼ^6,7など、いくつかのゲノム編集技術が特定の部位でゲノムを切断するように設計されていますが、これらのアプローチには複雑なタンパク質工学と冗長な実験手順が必要です。研究によると、II型原核生物クラスター化規則的インタースペース短回文反復(CRISPR)/Casシステムは、さまざまな細胞^{および種8,9,10,11}においてRNA誘導部位特異的DNA切断を特異的に媒介する効率的な遺伝子編集技術であることが示されています8,9,10,11。

プロトコル

1. CRISPR/Cas9遺伝子ノックアウトベクターの構築

1. ヒト CENP-E 遺伝子上の標的ゲノムDNA配列を選択します(GenBank Accession No.NM_001286734.2)を作成し、オンラインCRISPRデザインツール(http://crispor.tefor.net/)を使用してsgRNAを設計します。
2. ゲノム配列を1つ入力し、"Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + single nucleotide polymorphisms (SNPs): dbSNP148"のゲノムを選択し、プロトスペーサー隣接モチーフ"20 bp-NGG-spCas9"を選択します。特異度スコア⁵⁰、予測効率¹⁰、および最小のオフターゲットに従って、sgRNA-1、5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' および sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGCTC-3' の 2 つのガイド配列を選択します。
3. 一本鎖DNAオリゴヌクレオチド(ssODN)を注文して合成します。ddH₂O中のssODNを最終濃度100μMに希釈します。sgRNAオリゴをリン酸化してアニーリングするには、ポリメラーゼ....

ディスカッション

キネシン-7 CENP-Eは、細胞分裂中の染色体アライメントと紡錘体アセンブリチェックポイントにおける重要な調節因子です^17,19,20。CENP-Eの遺伝子欠失は、通常、紡錘体アセンブリチェックポイントの活性化、細胞周期停止、および細胞死をもたらします^27,29,51,52

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.5 mL centrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
24-well plate	Corning	3524
4S Gelred, 10,000x in water	Sangon Biotech (Shanghai)	A616697
50 mL centrifuge tube	Corning	430828
6 cm Petri dish	Corning	430166
95% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	10009164
96-well plate	Corning	3599
Acetic acid	Sinopharm Chemical Reagent	10000218	Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai)	A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0428	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Beyotime	A0423	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0460	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab254326	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376392	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab133583	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium	Beyotime	P0131	Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody	Abcam	ab7291	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer	Biotek Instruments	Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sinopharm Chemical Reagent	69003435
BpiI (BbsI)	Thermo Fisher Scientific	ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay	Promega	G3580
Centrifuge	Eppendorf	5424BK745380
Colchicine	Sinopharm Chemical Reagent	61001563
Confocal scanning microscope	Leica	Leica TCS SP8
Coverslip	CITOTEST	80344-1220
DAPI	Beyotime	C1006
DH5α competent cells	Sangon Biotech (Shanghai)	B528413
DL2000 DNA marker	TaKaRa	3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit	Omega	D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518251
Fetal bovine serum	Zhejiang Tianhang Biotechnology	11011-8611
Gentian violet	Sinopharm Chemical Reagent	71019944	Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution	Sinopharm Chemical Reagent	71020260
GraphPad Prism version 8.0 software	GraphPad	www.graphpad.com	Statistical analysis.
GSK923295	MedChemExpress	HY-10299
HeLa cell line	ATCC	CCL-2
Humidified incubator	Heal Force	HF90/HF240
Image J software	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	Image processing and analysis.
Inverted microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics	XD-202
LB agar powder	Sangon Biotech (Shanghai)	A507003
Lipo6000 transfection reagent	Beyotime	C0526
Nikon Ti-S2 microscope	Nikon	Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985070
Paraformaldehyde	Sinopharm Chemical Reagent	80096618	Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution	HyClone	SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518191
T4 DNA ligase	TaKaRa	2011A
T4 polynucleotide kinase	TaKaRa	2021A
TaKaRa Ex Taq	TaKaRa	RR001A
Triton X-100	Sinopharm Chemical Reagent	30188928	Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20	Sinopharm Chemical Reagent	30189328	Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.