Generazione di linee cellulari knockout CENP-E-/- associate al centromero della proteina E utilizzando il sistema CRISPR/Cas9

Riepilogo

Questo articolo riporta la costruzione di cellule knockout della proteina E associata al centromero (CENP-E) utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 e tre strategie di screening basate sul fenotipo. Abbiamo utilizzato la linea cellulare knockout CENP-E per stabilire un nuovo approccio per convalidare la specificità e la tossicità degli inibitori CENP-E, utile per lo sviluppo di farmaci e la ricerca biologica.

Abstract

Il sistema CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 è emerso come un potente strumento per l'editing genetico preciso ed efficiente in una varietà di organismi. La proteina-E ASSOCIATA AL CENTROMERO (CENP-E) è una chinesina diretta all'estremità positiva necessaria per la cattura del cinetocoro-microtubuli, l'allineamento cromosomico e il checkpoint dell'assemblaggio del fuso. Sebbene le funzioni cellulari delle proteine CENP-E siano state ben studiate, è stato difficile studiare le funzioni dirette delle proteine CENP-E utilizzando i protocolli tradizionali perché l'ablazione di CENP-E di solito porta all'attivazione del checkpoint dell'assemblaggio del fuso, all'arresto del ciclo cellulare e alla morte cellulare. In questo studio, abbiamo completamente eliminato il gene CENP-E nelle cellule HeLa umane e generato con successo le cellule CENP-E^-/- HeLa utilizzando il sistema CRISPR/Cas9.

Sono state stabilite tre strategie di screening ottimizzate basate sul fenotipo, tra cui lo screening delle colonie cellulari, i fenotipi di allineamento cromosomico e le intensità fluorescenti delle proteine CENP-E, che migliorano efficacemente l'efficienza dello screening e il tasso di successo sperimentale delle cellule knockout CENP-E . È importante sottolineare che la delezione di CENP-E provoca il disallineamento cromosomico, la posizione anomala delle proteine serina/treonina chinasi B (BubR1) del checkpoint mitotico BUB1 e difetti mitotici. Inoltre, abbiamo utilizzato il modello di cellula HeLa knockout di CENP-E per sviluppare un metodo di identificazione per inibitori specifici di CENP-E.

In questo studio è stato stabilito un approccio utile per convalidare la specificità e la tossicità degli inibitori di CENP-E. Inoltre, questo articolo presenta i protocolli di editing genetico CENP-E utilizzando il sistema CRISPR/Cas9, che potrebbe essere un potente strumento per studiare i meccanismi di CENP-E nella divisione cellulare. Inoltre, la linea cellulare knockout di CENP-E contribuirebbe alla scoperta e alla convalida degli inibitori di CENP-E, che hanno importanti implicazioni per lo sviluppo di farmaci antitumorali, studi sui meccanismi di divisione cellulare nella biologia cellulare e applicazioni cliniche.

Introduzione

L'editing genomico ingegnerizzato media le modificazioni mirate dei geni in una varietà di cellule e organismi. Negli eucarioti, la mutagenesi sito-specifica può essere introdotta dall'applicazione di nucleasi sequenza-specifiche che stimolano la ricombinazione omologa del DNA^{bersaglio 1}. Negli ultimi anni, diverse tecnologie di editing del genoma, tra cui le nucleasi a dita di zinco (ZFNs)^2,3, le nucleasi effettrici simili all'attivatore di trascrizione (TALEN)^4,5 e le meganucleasi homing ^6,7<....

Protocollo

1. Costruzione dei vettori di knockout del gene CRISPR/Cas9

1. Selezionare la sequenza di DNA genomico bersaglio sul gene umano CENP-E (GenBank Accession No. NM_001286734.2) e progettare l'sgRNA utilizzando uno strumento di progettazione CRISPR online (http://crispor.tefor.net/).
2. Inserire una singola sequenza genomica, selezionare il genoma di "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs): dbSNP148", e selezionare il motivo adiacente al protospaziatore "20 bp-NGG-spCas9". Scegliere due sequenze guida, tra cui sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' e sgRNA-2 5'-TTCTTTAGA....

Discussione

Kinesin-7 CENP-E è un regolatore chiave nell'allineamento cromosomico e nel checkpoint dell'assemblaggio del fuso durante la divisione cellulare 17,19,20. La delezione genetica di CENP-E di solito provoca l'attivazione del checkpoint dell'assemblaggio del fuso, l'arresto del ciclo cellulare e la morte cellulare 27,29,51,52.<.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.5 mL centrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
24-well plate	Corning	3524
4S Gelred, 10,000x in water	Sangon Biotech (Shanghai)	A616697
50 mL centrifuge tube	Corning	430828
6 cm Petri dish	Corning	430166
95% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	10009164
96-well plate	Corning	3599
Acetic acid	Sinopharm Chemical Reagent	10000218	Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai)	A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0428	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Beyotime	A0423	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0460	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab254326	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376392	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab133583	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium	Beyotime	P0131	Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody	Abcam	ab7291	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer	Biotek Instruments	Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sinopharm Chemical Reagent	69003435
BpiI (BbsI)	Thermo Fisher Scientific	ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay	Promega	G3580
Centrifuge	Eppendorf	5424BK745380
Colchicine	Sinopharm Chemical Reagent	61001563
Confocal scanning microscope	Leica	Leica TCS SP8
Coverslip	CITOTEST	80344-1220
DAPI	Beyotime	C1006
DH5α competent cells	Sangon Biotech (Shanghai)	B528413
DL2000 DNA marker	TaKaRa	3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit	Omega	D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518251
Fetal bovine serum	Zhejiang Tianhang Biotechnology	11011-8611
Gentian violet	Sinopharm Chemical Reagent	71019944	Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution	Sinopharm Chemical Reagent	71020260
GraphPad Prism version 8.0 software	GraphPad	www.graphpad.com	Statistical analysis.
GSK923295	MedChemExpress	HY-10299
HeLa cell line	ATCC	CCL-2
Humidified incubator	Heal Force	HF90/HF240
Image J software	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	Image processing and analysis.
Inverted microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics	XD-202
LB agar powder	Sangon Biotech (Shanghai)	A507003
Lipo6000 transfection reagent	Beyotime	C0526
Nikon Ti-S2 microscope	Nikon	Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985070
Paraformaldehyde	Sinopharm Chemical Reagent	80096618	Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution	HyClone	SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518191
T4 DNA ligase	TaKaRa	2011A
T4 polynucleotide kinase	TaKaRa	2021A
TaKaRa Ex Taq	TaKaRa	RR001A
Triton X-100	Sinopharm Chemical Reagent	30188928	Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20	Sinopharm Chemical Reagent	30189328	Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.