使用 CRISPR/Cas9 系统生成着丝粒相关蛋白- E CENP-E-/- 敲除细胞系

摘要

本文报道了使用 CRISPR/Cas9 系统和三种基于表型的筛选策略构建着丝粒相关蛋白-E （CENP-E） 敲除细胞的过程。我们利用 CENP-E基因敲除细胞系建立了一种新的方法来验证CENP-E抑制剂的特异性和毒性，这对药物开发和生物学研究很有用。

摘要

CRISPR（成簇的规则间隔短回文重复序列）/Cas9 系统已成为在各种生物体中进行精确和高效基因编辑的有力工具。着丝粒相关蛋白-E （CENP-E） 是着丝粒-微管捕获、染色体比对和纺锤体组装检查点所需的正端定向驱动蛋白。尽管 CENP-E 蛋白的细胞功能已得到充分研究，但使用传统方案研究 CENP-E 蛋白的直接功能一直很困难，因为 CENP-E 消融通常会导致纺锤体组装检查点激活、细胞周期停滞和细胞死亡。在这项研究中，我们完全敲除了人类HeLa细胞中的 CENP-E 基因，并利用CRISPR/Cas9系统成功生成了 CENP-E^-/- HeLa细胞。

建立了细胞集落筛选、染色体比对表型、CENP-E蛋白荧光强度等3种基于表型的优化筛选策略，有效提高了 CENP-E 敲除细胞的筛选效率和实验成功率。重要的是， CENP-E 缺失会导致染色体错位、BUB1 有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸激酶 B （BubR1） 蛋白的异常位置和有丝分裂缺陷。此外，我们还利用 CENP-E 敲除HeLa细胞模型开发了CENP-E特异性抑制剂的鉴定方法。

在这项研究中，已经建立了一种验证 CENP-E 抑制剂特异性和毒性的有用方法。此外，本文还介绍了使用CRISPR/Cas9系统 进行CENP-E 基因编辑的方案，这可能是研究CENP-E在细胞分裂中机制的有力工具。此外， CENP-E基因敲除细胞系将有助于CENP-E抑制剂的发现和验证，对抗肿瘤药物开发、细胞生物学中细胞分裂机制的研究以及临床应用具有重要意义。

引言

工程基因组编辑介导各种细胞和生物体中基因的靶向修饰。在真核生物中，可以通过应用序列特异性核酸酶来引入位点特异性诱变，这些核酸酶刺激靶 DNA¹ 的同源重组。近年来，几种基因组编辑技术，包括锌指核酸酶 （ZFNs）^2,3、转录激活因子样效应核酸酶 （TALENs）^4,5 和归巢巨核酸酶 ^6,7，^已被设计用于在特定位点切割基因组，但这些方法需要复杂的蛋白质工程和冗余的实验程序。研究表明，II 型原核生物簇状规则间隔短回文重复序列 （CRISPR）/Cas 系统是一种高效的基因编辑技术，可特异性介导多种细胞和物种中的 RNA 引导的位点特异性 DNA 切割 8,9,10,11。CRISPR/Cas9 基因敲除技术彻底改变了基础生物学、生物技术和医学领域^1....

研究方案

1. CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建

1. 选择人类 CENP-E 基因上的靶基因组DNA序列（GenBank登录号。NM_001286734.2） 并使用在线 CRISPR 设计工具 （http://crispor.tefor.net/） 设计 sgRNA。
2. 输入单个基因组序列，选择“Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 （hg38 analysis set） + single nucleotide polymorphisms （SNPs）： dbSNP148”的基因组，选择原间隔区相邻基序“20 bp-NGG-spCas9”。根据特异性评分⁵⁰分、预测效率¹⁰分和最小脱靶率，选择sgRNA-1、5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3'和sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3'两个引导序列。
3. 订购并合成单链 DNA 寡核苷酸 （ssODN）。将ddH₂O中的ssODN稀释至终浓度为100μM。为了磷酸化和退火sgRNA寡核苷酸，在聚合酶链反应（PCR）管中加入1μL正向寡核苷酸，1μL反向寡核苷酸，0.5μLT4多核苷酸激酶，1μLT4多核苷酸激酶缓冲液和6.5μL无RNase水，并在37°C孵育管30分钟，95°....

讨论

驱动蛋白-7 CENP-E 是细胞分裂过程中染色体排列和纺锤体组装检查点的关键调节因子 17,19,20。CENP-E 的基因缺失通常会导致纺锤体组装检查点的激活、细胞周期停滞和细胞死亡 27,29,51,52。因此，构建稳定的CENP-E敲除细胞系是CENP.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.5 mL centrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
24-well plate	Corning	3524
4S Gelred, 10,000x in water	Sangon Biotech (Shanghai)	A616697
50 mL centrifuge tube	Corning	430828
6 cm Petri dish	Corning	430166
95% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	10009164
96-well plate	Corning	3599
Acetic acid	Sinopharm Chemical Reagent	10000218	Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai)	A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0428	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Beyotime	A0423	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0460	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab254326	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376392	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab133583	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium	Beyotime	P0131	Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody	Abcam	ab7291	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer	Biotek Instruments	Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sinopharm Chemical Reagent	69003435
BpiI (BbsI)	Thermo Fisher Scientific	ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay	Promega	G3580
Centrifuge	Eppendorf	5424BK745380
Colchicine	Sinopharm Chemical Reagent	61001563
Confocal scanning microscope	Leica	Leica TCS SP8
Coverslip	CITOTEST	80344-1220
DAPI	Beyotime	C1006
DH5α competent cells	Sangon Biotech (Shanghai)	B528413
DL2000 DNA marker	TaKaRa	3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit	Omega	D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518251
Fetal bovine serum	Zhejiang Tianhang Biotechnology	11011-8611
Gentian violet	Sinopharm Chemical Reagent	71019944	Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution	Sinopharm Chemical Reagent	71020260
GraphPad Prism version 8.0 software	GraphPad	www.graphpad.com	Statistical analysis.
GSK923295	MedChemExpress	HY-10299
HeLa cell line	ATCC	CCL-2
Humidified incubator	Heal Force	HF90/HF240
Image J software	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	Image processing and analysis.
Inverted microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics	XD-202
LB agar powder	Sangon Biotech (Shanghai)	A507003
Lipo6000 transfection reagent	Beyotime	C0526
Nikon Ti-S2 microscope	Nikon	Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985070
Paraformaldehyde	Sinopharm Chemical Reagent	80096618	Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution	HyClone	SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518191
T4 DNA ligase	TaKaRa	2011A
T4 polynucleotide kinase	TaKaRa	2021A
TaKaRa Ex Taq	TaKaRa	RR001A
Triton X-100	Sinopharm Chemical Reagent	30188928	Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20	Sinopharm Chemical Reagent	30189328	Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.